豬卵巢顆粒細胞的體外培養

摘 要：顆粒細胞是豬卵泡的重要組成，其生長及形態功能變化伴隨著卵泡的整個發育過程，同時也是研究細胞增殖、分化、信號轉導等重要的細胞模型。本試驗旨在篩選和摸索原代培養顆粒細胞的理想培養基及培養過程，分別使用DMEM高糖、DMEM/F12、M199、1640完全培養基（86%培養基+12%胎牛血清+1%雙抗+1%慶大霉素兩性霉素混合液）接種豬卵巢顆粒細胞，置于37 ℃、體積分數5%的CO2、飽和濕度的細胞培養箱中進行培養，每12 h觀察細胞生長狀態及形態特征，建立體外培養體系。結果顯示，DMEM高糖培養基中，細胞增殖速度快，細胞狀態好，細胞形態清晰，培養效果最佳，同時，經FSHR免疫熒光鑒定，分離的細胞為豬卵巢顆粒細胞，且純度大于98%，說明DMEM高糖培養基在建立體外原代細胞培養體系中效果明顯。

關鍵詞：顆粒細胞；DMEM高糖；原代培養；FSHR鑒定

在畜牧生產中，繁殖性能是一項重要指標，決定了生豬養殖的經濟效益。母豬的排卵數是影響繁殖性能的主要因素之一，卵巢顆粒細胞作為卵泡的功能細胞，其凋亡與卵泡的閉鎖高度相關，直接影響母豬排卵數目。同時，顆粒細胞作為卵泡中最大的細胞群，具有強大的分泌功能，卵母細胞可以通過與其之間的間隙連接獲取所需的營養物質，從而發育至成熟[1-2]。在岳永明等的研究中發現，顆粒細胞除了為卵母細胞提供營養之外，還能夠調控其生長過程中特異性蛋白質合成水平等代謝過程。對于卵巢顆粒細胞的體外培養，Channing[3]等首次在血清培養基中培養出結構和功能出現分化的顆粒細胞，在此之后，學者們也進行了豬[4]、牛[5]、大鼠[6]、小鼠[7]等動物的卵巢顆粒細胞的體外培養，但還沒有明確有效的培養方法。本研究旨在通過四種培養基的培養篩選最高效和穩定的培養方法，為今后原代細胞培養方法的建立提供參考。

1 試驗材料

卵巢來源：試驗選用杜×長×大三元雜交健康母豬，常規飼養至100 kg左右。試驗豬采用屠宰場流程進行屠宰，做好宰前檢驗后進行麻電擊暈，刺殺放血，然后對豬進行清洗、去毛。在剖開腹部之后，去除內臟之前采集豬的卵巢組織，避免與其他內臟混合后造成污染。挑選發育正常、無黃體、卵泡多而飽滿的卵巢，用PBS緩沖液清洗保存于冰盒中迅速送回無菌操作室。

試劑、培養基：DMEM高糖培養基、青霉素與鏈霉素混合液、慶大霉素、兩性霉素b、PBS溶液、EDTA-胰蛋白酶購于Hyclone公司，DMEM/F12培養基、M199培養基、1640培養基、PBS粉末、Triton X-100、5%BSA、DAPI染色液購于Solarbio公司，胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶購于Gibco公司，一抗（FSHR Antibody（N-20））購于Santa Cruz Biotechnology公司，二抗（Cy3–conjugated Affinipure Rabbit Anti- Goat IgG（H+L））購于Proteintech公司，CCK8細胞增殖/毒性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。DMEM 完全培養配方：86%培養基+12%胎牛血清+1%雙抗+1%慶大霉素兩性霉素混合液。

2 試驗方法

2.1 豬顆粒細胞的分離

收集體重約100 kg健康母豬的卵巢后，用配好的PBS溶液沖洗卵巢兩次，將沖洗干凈的卵巢迅速放進裝有PBS溶液的器皿中，置于冰上帶回，用紫外燈照射器皿15 min后移入實驗室。超凈工作臺做好消毒滅菌工作后將器皿放入，將豬卵巢取出移入無菌培養皿中，PBS溶液重復洗滌3次。選取直徑3 mm～8 mm的卵泡，用1 mL一次性注射器抽取卵泡液及卵泡壁上的顆粒細胞（避開血管），轉至裝有培養基的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用培養基重懸余下的顆粒細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，將細胞沉淀平均分成四份接種于60 mm培養皿中，每個培養皿加入配好的完全培養基（83%培養基+15%胎牛血清+1%雙抗+1%慶大霉素兩性霉素混合液）5 mL，米字形晃動培養皿使細胞均勻分散，置于37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。

2.2 培養基的篩選

將細胞分別用DMEM高糖、DMEM/F12、M199、1640完全培養基（86%培養基+12%胎牛血清+1%雙抗+1%慶大霉素兩性霉素混合液）稀釋，接種于60 mm培養皿中移至細胞培養箱中培養，每12 h觀察細胞生長狀態及形態特征。細胞貼壁后用巴氏吸管棄去培養皿內的舊培養液，預熱后的PBS溶液洗滌細胞3次，每個培養皿加入2 mL PBS溶液，于倒置顯微鏡下觀察不同培養基培養的細胞貼壁率及細胞形態。

2.3 卵巢顆粒細胞鑒定

用含EDTA的胰蛋白酶將生長旺盛的卵巢顆粒細胞消化下來，按每孔1.5×104個接種于24孔板中，再加入1 mL細胞培養液。細胞貼壁 24 h后，棄去培養液，每孔加入1 mL PBS溶液于37 ℃培養箱繼續培養1 h，以漂洗血清蛋白。棄去孔內PBS溶液，加入4%多聚甲醛固定細胞10 min，后用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。再加入0.5%Triton溶液通透細胞10 min，之后再用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。然后加入5%BSA溶液，室溫下封閉30 min。吸去BSA溶液，不用PBS漂洗，滴加由1%BSA溶液稀釋后的一抗（抗體與BSA溶液1﹕20稀釋）， 37 ℃培養箱孵育2 h，再用PBS溶液漂洗3次，每次5 min，滴加1% BSA溶液稀釋的二抗（抗體與BSA溶液1﹕50稀釋），37 ℃培養箱孵育1 h。再漂洗3次，每次5 min。最后滴加DAPI染色液，室溫下染色5 min置于倒置熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照，使用Image Pro Plus軟件處理圖片。

2.4 卵巢顆粒細胞生長曲線的繪制

將培養皿從培養箱中取出，顯微鏡下觀察，當原代卵巢顆粒細胞匯聚至90%左右，開始細胞傳代。首先棄去培養皿中的舊液，用預熱的PBS溶液洗滌細胞，輕輕搖晃培養皿，棄去PBS溶液，重復3次。培養皿中加入1 mL含EDTA的胰蛋白酶消化液，輕輕晃動使消化液分布均勻，放入37 ℃培養箱中消化2.5 min，顯微鏡下觀察，當發現胞質回縮、變圓、細胞間隙增大后，輕輕拍打培養皿底部，使細胞脫離培養皿，隨后加入3 mL含有FBS的細胞培養液，終止消化。再將培養皿中的細胞懸液轉移至15 mL的離心管中，繼續加入新鮮培養基于培養皿中，吹打數下，使附在皿底的細胞脫落，最后將培養基轉移至15 mL離心管中，與前面的細胞懸液混合。使用1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入4 mL細胞培養液重懸細胞，繼續使用1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL細胞培養液重懸細胞，補加2 mL細胞培養液混合，吹打數下使細胞混合均勻。取100 μL細胞懸液與臺盼藍染料1﹕1混合均勻，用計數板計數，根據細胞懸液細胞數/mL=四大格細胞總數/4×10 000×稀釋倍數的公式計算出細胞總數。調整細胞懸液濃度，將卵巢顆粒細胞以0.5×104 個/100 μL每孔接種于96孔板中，置于37 ℃培養箱中培養，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h后取出，棄去舊液，加入100 μL含10% CCK8試劑的細胞培養液，置于37 ℃細胞培養箱中繼續孵育3 h，最后，在酶標儀中以450 nm波長檢測OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制出卵巢顆粒細胞生長曲線。

3 結果與分析

3.1 豬卵巢顆粒細胞的原代培養

觀察發現，24 h后顯微鏡視野內有大量漂浮物，難以觀察細胞貼壁情況，分別于培養24 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h后，發現培養72 h后細胞貼壁率達到較高值，貼壁牢，所以后續試驗選擇在細胞初次接種后72 h后進行換液，之后每隔24 h換一次液。培養過程中要注意做好消毒滅菌措施，保證細胞在無污染環境下培養。

3.2 不同培養基對豬卵巢顆粒細胞貼壁率的影響

如圖1所示，在DMEM高糖培養基中生長的細胞增殖速度快，細胞狀態好，細胞形態清晰；在M199培養基中培養的細胞生長較快，貼壁數量多，細胞形態好，僅稍次于DMEM高糖培養基；用DMEM/F12培養基培養的細胞生長較慢，不貼壁細胞較多，且會出現較多的空泡；1640培養基培養下的卵巢顆粒細胞貼壁率低，分布零散，有大量空泡，且細胞形態不清晰。

3.3 豬卵巢顆粒細胞原代培養的形態學觀察

如圖2所示，在倒置顯微鏡觀察，豬卵巢顆粒細胞呈單層貼壁生長，細胞體積大，形態完整，邊緣清晰，多為梭形、星形、多邊形或三角形，細胞內有大量黑色顆粒，伴有少量空泡。細胞在貼壁初期，部分集中分布，呈火山堆積狀，火山中間折光性強，朝四周擴散；部分零散分布，細胞之間間隙大，有未貼壁細胞懸浮；繼續培養一段時間后，細胞之間間隙消失，布滿培養皿；說明細胞在增殖的同時由密集向稀疏部位遷徙。繼續培養發現細胞形態由多邊形慢慢變為呈纖維狀。經胰蛋白酶后的細胞回縮，變圓，形態飽滿；消化后的細胞進行傳代重新接種于培養皿后，細胞貼壁時間縮短，貼壁更牢，細胞體積變大，重新變為梭形或多邊形，細胞與細胞之間有延長的絲狀突起相互連接。

3.4 豬卵巢顆粒細胞鑒定

免疫熒光染色的顆粒細胞如圖3，其中A為空白對照組，表現為細胞核染成藍色，細胞質不著色；B為表達FSHR抗體的細胞，我們發現經FSHR抗體孵育后的細胞質被染成紅色；C為利用Image Pro Plus軟件合成的細胞圖片。同時表現為細胞核為藍色、細胞質為紅色的細胞為卵巢顆粒細胞。鏡下計數顯示，表達FSHR陽性細胞>98%。試驗表明，通過此方法分離得到的細胞為豬卵巢顆粒細胞，且純度大于98%，可以用于后續試驗。

3.5 豬卵巢顆粒細胞生長曲線

卵巢顆粒細胞生長曲線如圖4，培養0～24 h，細胞處于貼壁適應期，24 h～48 h之間，細胞生長緩慢，呈小幅度上升；48 h～120 h之間，細胞分裂旺盛，呈較快的上升趨勢，細胞開始大量增殖，在120 h時，OD值達到峰值；120 h之后，細胞增殖減緩，呈下降趨勢。144 h～ 168 h之間，OD值有小幅度上升。

4 討論

顆粒細胞作為卵泡中最大的細胞群，通過與卵母細胞的間隙連接，對卵泡的發育起著重要的作用，一方面，顆粒細胞促進顆粒細胞為卵母細胞提供小分子物質，促進其發育，一方面，卵母細胞也促進了顆粒細胞的發育，這種作用是相互的[8]。由于原代豬卵巢顆粒細胞可以最大限度地保留細胞特性，使體外實驗更接近于體內環境，因此，建立一個方便、高效、穩定的顆粒細胞分離培養方法是評價卵巢功能與卵母細胞質量的重要途徑。對現有的顆粒細胞體外培養的方法仍有許多需要改進的地方。Kossowska等[9]通過流式細胞儀來篩選帶顆粒細胞標志基因的細胞，以此確定細胞純度后進行培養；Varras等[10]采用直接從卵泡膜上刮取的方法獲得細胞；陳毅斐等[11]通過劃破卵泡，釋放出其中顆粒細胞的方法獲得細胞。其中，趙芳等[12]的分離方法與本實驗相似，都是通過直接抽取卵泡液來獲取顆粒細胞。試驗證明，這種方法得到的豬卵巢顆粒細胞純度較高，且操作簡單。此外，不同的基礎培養基、不同的血清濃度、不同的添加因子等都影響著卵巢顆粒細胞的體外培養。劉曉鵬等[13]研究表明，單獨培養的顆粒細胞與同卵母細胞一起培養的顆粒細胞貼壁率存在很大差別，不同大小的卵泡中分離的顆粒細胞也表現出不同的細胞特性，小卵泡中分離的顆粒細胞增殖能力更強，越趨于成熟的卵泡中分離的顆粒細胞增殖特性越不明顯。說明顆粒細胞在卵泡的不同發育階段都能發揮作用，為卵泡的優勢選擇做出貢獻。

顆粒細胞在體外培養一般經過兩三次傳代就會停止生長[14]。試驗選在細胞分離培養4 d后進行試驗，此時細胞生長旺盛，細胞狀態佳，適合進行后續試驗。但因其傳代易老化的特點，每一部分試驗都需重新分離細胞，這大大增加了試驗的繁復性。原代細胞培養過程中需格外注意分離細胞時的無菌操作，以及培養環境的無污染要求。由于DMEM高糖培養基培養下的豬卵巢顆粒細胞貼壁數量多，貼壁時間短，細胞形態清晰，狀態良好，說明DMEM高糖培養基對豬顆粒細胞有良好的促進作用，因此，在后續試驗中，選用DEME高糖培養基進行試驗。生長曲線結果顯示顆粒細胞培養48 h到120 h之間都處于增殖旺盛期，根據試驗結果及其他學者的研究經驗，后續試驗選擇在細胞培養72 h后進行檢測分析。

參考文獻：（14篇，略）