豬流行性腹瀉的診斷技術概述

摘 要：豬流行性腹瀉病毒可引起感染豬嚴重腹瀉與脫水，對仔豬有很高的致死率，給全球養豬業帶來了重大經濟損失，尤其對包括中國在內的亞洲國家的養豬業造成越來越嚴重的危害。豬流行性腹瀉的診斷方法主要有臨床癥狀與病理學診斷以及基于儀器設備的實驗室診斷，如病毒分離鑒定、病毒血清中和試驗、免疫電鏡觀察、免疫熒光檢測、酶聯免疫吸附試驗、聚合酶鏈式反應以及環介導等溫擴增技術等。然而要確診該病，必須結合各種檢測手段綜合判定。

關鍵詞：豬流行性腹瀉；診斷；概述

中圖分類號：S851 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2017）10-0046-03

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一種嚴重的傳染性疾病。豬流行性腹瀉病毒屬冠狀病毒，主要感染豬小腸細胞，造成感染豬嘔吐、腹瀉及脫水[1]。大齡豬感染后，主要表現為體弱與體重減輕；新生仔豬感染后，通常在5 d內死亡。雖然豬流行性腹瀉最先發現于歐洲，但目前主要對亞洲國家的養豬業造成嚴重危害。在我國已經有二十多個省存在該病[2]，并且存在許多各種年齡豬都易感的豬群[3]。豬流行性腹瀉病毒也已經傳播至北美國家，在2013年5月，美國印第安納州首次檢測到該病毒。由于豬流行性腹瀉的高傳染性，尤其對仔豬造成嚴重的致病率與致死率，給全球養豬業帶來嚴重經濟損失，因而對該病的診斷與防控，越來越受到研究人員的重視。本文概述該病的診斷技術，為豬場控制該病提供參考。

1 豬流行性腹瀉的診斷

1.1 臨床癥狀及病理學診斷

豬流行性腹瀉的臨床癥狀一般表現為嚴重的黃色水樣腹瀉，并伴有嘔吐現象，全身脫水，體型明顯消瘦。病豬精神萎靡，眼窩下陷，食欲減退或廢絕，患病仔豬在腹瀉3 d～4 d天后，因嚴重脫水而死亡。病死豬解剖后，從外觀上看，腸道明顯膨大，腸內有水樣糞便滯留，相比健康仔豬小腸壁明顯變薄，腸系膜常出現充血，部分豬偶見胃底部黏膜層黏膜壞死。

1.2 實驗室診斷

1.2.1 病毒的分離鑒定

對疑似感染豬流性腹瀉病毒的豬只，刮取少許腸道內容物，用磷酸鹽緩沖液浸泡1 h后，高速離心，取上清接種Vero細胞，培養過夜后觀察細胞病變，若生長的Vero細胞出現圓縮、壞死以及從瓶壁上脫落等情況后，遂進行病毒分離，而后對分離后的病毒進行各種分子病毒學鑒定。通過病毒分離鑒定診斷豬流行性腹瀉病毒，雖然試驗條件要求嚴格、操作步驟多、檢測周期較長，但該方法是檢測該病的最為準確的方法。

1.2.2 病毒微量血清中和試驗

微量血清中和試驗的原理為，預先將病毒與血清中的特異性抗體作用后，病毒繼而失去致病力，接種到細胞后不再有細胞病變的產生，通過觀察細胞病變即可進行鑒別診斷。最早在1994年，林志雄等利用PK-15傳代細胞作為指示性細胞，使用豬流行性腹瀉病毒PEDV G1株，建立了檢測豬流行性腹瀉病毒的微量血清中和試驗。結果表明，該方法能準確檢測PEDV，同時對其他病毒進行的鑒別診斷也顯示，豬瘟、輪狀病毒病、豬偽狂犬病等病毒病的陽性血清皆不能有效中和豬流行性腹瀉病毒，表明該檢測方法特異性好、結果準確可靠、具有較高的敏感性[4]。但該方法需要進行體外細胞培養，不適于臨床實踐中對PEDV的快速檢測。

1.2.3 免疫電鏡法

由于冠狀病毒屬是一類具有外套膜的正鏈單股RNA病毒，在電鏡下觀察均具有相近的形態特征，所以無法通過電鏡觀察直接鑒別PEDV，而借助免疫電鏡的方法就能鑒別診斷。王繼科等把抗原和抗體分別高速離心后，又對抗原-抗體復合物高速離心，最后在電鏡下觀察到典型的病毒粒子與抗體形成的免疫復合物，建立了改進型的直接免疫電鏡法[5]。該方法簡捷、直觀、快速，并可作為鑒別診斷PEDV和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）的手段之一。但免疫電鏡法由于設備的限制，不適于大規模的臨床檢測。

1.2.4 免疫熒光技術檢測

免疫熒光技術是熒光抗體技術中的一種，利用熒光標記抗體與抗原的特異性結合后，在熒光顯微鏡下檢測得出結果，具有較高的準確性與特異性。利用免疫熒光技術檢測PEDV的簡要操作過程為：取發病豬小腸組織，低溫冷凍后，制作冰凍切片或黏膜抹片，用丙酮固定30 min后，加入特異性熒光抗體充分反應后，用水充分洗去未反應的多余熒光抗體，置室溫下干燥后，于熒光顯微鏡下觀察便可獲取檢測結果。崔現蘭等建立了直接免疫熒光技術用于PED的檢測，試驗結果顯示，對PEDV人工感染仔豬的陽性檢出率為91.4%，比電鏡觀察陽性檢出率要高，后者陽性檢出率僅67.4%，表明所建立的免疫熒光法相比電鏡觀察法更為靈敏可靠[6]。比較用于熒光檢測的冰凍切片與空腸黏膜涂片的檢測效果，發現前者優于后者。雖然該方法較為直觀快速，但由于需要獲取小腸病料，故而不能用于發病初期的檢測，在臨床診斷中具有一定的局限性。

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）

ELISA法可以直接利用病豬的糞便作為檢測樣本，當疑似病豬出現了腹瀉癥狀時，可立即提取樣本開展檢測，有利于對病豬早診斷、早治療。孫智鋒等利用純化的PEDV與酶標記的葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA）建立了SPA-ELISA法，該方法具有簡捷、敏感、特異、快速的特點，可用于免疫豬的血清PEDV抗體的動態監測以及臨床自然感染豬的檢測[7]。鄒勇等建立的ELISA法，可鑒別診斷PEDV、TGEV以及輪狀病毒（Rotavirus，RV），應用到臨床檢測表明，未經免疫的豬場，PEDV血清抗體的陽性檢出率接近100%，部分豬場呈現PEDV與TGEV的混合感染，另外RV陽性血清抗體水平普遍也很高[8]。目前在ELISA法原理的基礎上，已經建立了間接ELISA、競爭阻斷ELISA、雙抗體夾心法ELISA以及Dot-ELISA 法等多種診斷方法。

1.2.6 反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測

隨著現代分子生物學的快速發展，RT-PCR技術成為檢測PEDV的最有效的技術手段之一。國內外的研究人員均對此均進行了深入研究。吳凌等設計合成了PEDV M基因的兩對特異性引物，應用RT-PCR技術，擴增出PEDV M基因的長度為854 bp的全長片段，在對照組Vero培養基中未擴增出特異產物[9]。2015年，徐旭東等針對PEDV的S基因的保守序列設計特異性引物，成功對感染PEDV的病豬進行了檢測，并證實該特異性引物可以鑒別其他引起仔豬腹瀉的病原[10]。在此基礎上，研究人員也開發了多重PCR、巢式PCR、熒光定量PCR等方法。Ben Salem等建立了多重巢式PCR用于檢測豬腸道病毒（PEDV、TGEV以及RV），175份腹瀉病豬的樣本，同時進行PEDV、TGEV與RV的檢測表明，4%呈現PEDV與RV的混合感染，25%單純感染PEDV，41%單純感染RV[11]。劉鄧等基于PEDV N基因序列，設計一對特異性引物與探針，以包含N基因的pMD18-T質粒作為標準品，建立了一種能快速定量PEDV含量的TaqMan熒光定量RT-PCR法，該方法的線性檢測范圍可達10拷貝/μL～108拷貝/μL，敏感性與特異性顯著高于常規的RT-PCR法[12]。但由于RT-PCR法需要使用熒光定量PCR儀，操作也相對復雜，在臨床推廣上有較大限制，目前仍只能用于實驗室檢測。

1.2.7 逆轉錄環介導等溫擴增技術（RT-LAMP）

LAMP技術利用4條特殊設計的引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒定溫度下特異、高效、快速擴增目標DNA。RT-LAMP的檢測是在LAMP技術的基礎上，在反應體系內加入了逆轉錄酶，在反轉錄RNA的同時進行DNA擴增，省去了傳統RT-PCR的先行反轉錄步驟。Ren等建立了一種RT-LAMP，該方法針對PEDV N基因設計6條特異性引物，63 ℃反應50 min即可出結果，不僅能從臨床病料中檢測PEDV，還能對TGEV、PRV、PRRSV等多種進行鑒別診斷，同時具有比常規RT-PCR技術及ELISA更高的敏感性[13]。LAMP 相比常規的PCR檢測，LAMP檢測對設備要求簡單，只需一個加熱器即可，更適合于臨床。

2 結語

由于許多病原都能引起豬腹瀉并且臨床癥狀又非常相似，如PEDV與豬瘟、傳染性胃腸炎、輪狀病毒病、豬偽狂犬病、副傷寒、豬痢疾、增生性腸病、等孢球蟲病等疾病的臨床癥狀都有較大相似性，而在實際情況中，豬腹瀉并不是由單一病原引起，往往由多種病原混合感染導致，這就加大了病原診斷的難度。總之，PEDV不能單純依靠臨床癥狀和組織病理學變化來診斷。要確診本病，必須依靠上述各種實驗室技術手段綜合檢測判定。

參考文獻：（13篇，略）