基因技術(shù)在大豆抗病蟲(chóng)害育種上的應(yīng)用研究

付海濤

1大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用

1.1基因槍法

基因槍法，亦稱(chēng)為微彈轟擊法，具體應(yīng)用流程如下所示：首先，讓DNA粘附在鎢粉或者金粉粒子，即微載體的表層，其后，將高壓放電或者氣體作為驅(qū)動(dòng)力，最后，將金屬微粒導(dǎo)入目標(biāo)植被細(xì)胞之中，以實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。這一基因轉(zhuǎn)移技術(shù)最早由美國(guó)學(xué)者Sanford等研究者提出，其后在1988年，Mcca等研究者利用基因槍法射擊大豆胚芽的生長(zhǎng)點(diǎn)，誘引不定芽出現(xiàn)并形成完整的大豆植株，最終獲取了轉(zhuǎn)基因大豆。基因槍法主要的轉(zhuǎn)化受體對(duì)象為幼胚的軸桿、尖端、懸浮細(xì)胞和未成熟的胚芽莖桿尖端，其后應(yīng)用潮霉素選擇轉(zhuǎn)化植株。

基因槍法的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于：第一，不會(huì)受到基因組織類(lèi)型的影響；第二，遺傳轉(zhuǎn)化率較高；第三，能夠有效轉(zhuǎn)移重組的完整DNA或者DNA片段。而該技術(shù)的缺陷在于相較于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，其所需消耗的成本更高，而且技術(shù)操作難度較大，同時(shí)由于基因拷貝數(shù)量較多，極易導(dǎo)致基因沉默現(xiàn)象的出現(xiàn)。

1.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

土壤中最為常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌就是農(nóng)桿菌，其可在自然環(huán)境下自發(fā)性地感染絕大部分的雙子葉植被的損傷部位，并誘發(fā)植被生成發(fā)狀根或者冠癭瘤。農(nóng)桿菌通過(guò)誘引根質(zhì)粒（Ri）或者瘤細(xì)胞質(zhì)粒（Ti），將其中一部分特殊的DNA片段導(dǎo)入寄主細(xì)胞的基因組中，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的作用原理在于應(yīng)用分子克隆技術(shù)在Ri或者Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域內(nèi)添加擬轉(zhuǎn)基因，借助農(nóng)桿菌的感染作用將攜帶的T-DNA插入植被細(xì)胞，同時(shí)將擬轉(zhuǎn)基因添入至植被基因組，以此來(lái)引發(fā)相應(yīng)的植被細(xì)胞遺傳的轉(zhuǎn)化。現(xiàn)階段，研究人員已研發(fā)了多種能應(yīng)用于轉(zhuǎn)化植被基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒裝載系統(tǒng)。

Hinchee等研究者首先通過(guò)應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲取了大豆轉(zhuǎn)基因植株，其后，轉(zhuǎn)基因大豆成績(jī)斐然，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也成了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換大豆遺傳的重要方式之一。下面，筆者將列舉幾個(gè)應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的成功案例，具體如下所示：其一，Parrot等研究者應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染大豆尚未成熟的子葉，并得到了大豆轉(zhuǎn)基因植株；其二，王慧中等研究者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染大豆頂端胚芽，篩選出抗性愈傷部位，最終獲得了抗性芽，通過(guò)生化檢測(cè)可知胚芽包含冠癭堿；其三，徐香玲等研究者利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒裝載系統(tǒng)，成功將內(nèi)毒素基因?qū)霒|北大豆黑龍37和39等多個(gè)品種，其后誘導(dǎo)其發(fā)芽成型，通過(guò)選擇檢測(cè)可知，內(nèi)毒素基因已成功整合至大豆基因組之中。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的應(yīng)用成功率會(huì)受到T-DNA轉(zhuǎn)化效率、大豆基因組類(lèi)型、植被培養(yǎng)條件、農(nóng)桿菌感染性以及篩選形式等諸多因素的影響，因而如何進(jìn)一步提升農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)換效率就成了未來(lái)研究工作的主要方向。

1.3花粉管通道法

該技術(shù)手段的應(yīng)用原理為：將含有目標(biāo)基因的DNA放置于剛完成授粉并已切割的花柱之上，其后DNA就會(huì)順著花粉管抵達(dá)胚珠，進(jìn)而將其插入至胚珠基因組之中，當(dāng)帶有外來(lái)基因的受精卵生長(zhǎng)發(fā)育成成熟植株時(shí)，就可獲取轉(zhuǎn)基因植株。應(yīng)用花粉管通道法插入外來(lái)基因的手法主要有柱頭滴加法、子房微注射法、生殖細(xì)胞浸染法以及花粉粒外攜法等等。這一方法首先應(yīng)用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，其后擴(kuò)展到其它農(nóng)作物。雷勃均等人是最早應(yīng)用花粉管通道法實(shí)現(xiàn)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究者，其后眾多研究人員也相繼進(jìn)行了這一領(lǐng)域的研究，并成功培育出了抗病大豆品種，如劉博林等研究者就應(yīng)用了子房微注射法，將龍葵的Atrazine基因?qū)胫链蠖怪校柚磕ê碗s交等手段，最終獲取了大豆轉(zhuǎn)基因植株。雖然花粉管通道法操作較為簡(jiǎn)單，但研究人員也需對(duì)外來(lái)基因射入時(shí)間、方式以及后代篩選等問(wèn)題進(jìn)行進(jìn)一步地探究。

2大豆抗病毒基因的應(yīng)用

2.1Bt晶體蛋白毒素基因

Bacillus Thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)為Bt，中文學(xué)名為蘇云金桿菌，一般稱(chēng)之為殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白。Bt晶體蛋白毒素基因在多種農(nóng)作物的病蟲(chóng)害防治上有著較強(qiáng)的毒殺功用，同時(shí)其對(duì)人類(lèi)、畜牧以及害蟲(chóng)的天敵則無(wú)毒性，是現(xiàn)階段在轉(zhuǎn)基因抗病蟲(chóng)害和育種領(lǐng)域應(yīng)用較為成熟的一種基因。1977年，徐香玲等研究者借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功將PKT54B7C5中的Bt-K8晶體蛋白毒素基因射入東北大豆黑農(nóng)37和39等多個(gè)品種之中，并獲取了再生大豆植株，經(jīng)過(guò)SOurthen和PCR的雜交測(cè)試可知，Bt-K8晶體蛋白毒素基因已成功整合至大豆基因組之中。2011年，李希臣等研究者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將Bt（crylA）晶體蛋白毒素基因?qū)氪蠖埂?/p>

2.2大豆病毒外殼蛋白基因

現(xiàn)階段，研究者將克隆完成的大豆病毒外殼蛋白基因，即TMY-導(dǎo)入植被體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，植株出現(xiàn)了一定程度的抗性。施樹(shù)良等研究者利用質(zhì)粒介導(dǎo)土豆病毒外殼蛋白基因?qū)嵰约拜攲?dǎo)煙草病毒外殼蛋白基因，兩者方式均實(shí)現(xiàn)了大豆遺傳的轉(zhuǎn)化并獲取了大豆再生植株。1996年， 李興華等研究者應(yīng)用包含質(zhì)粒的大豆花葉病毒外殼蛋白基因，即發(fā)根農(nóng)桿菌浸染大豆品種，最終獲取了轉(zhuǎn)化大豆植株，從而為大豆抗病蟲(chóng)害育種提供了全新的研究思路。

2.3CpTi基因

CpTi，即植物蛋白酶抑制劑，其是一種天然的抗病蟲(chóng)害物質(zhì)。通過(guò)應(yīng)用物蛋白酶抑制劑，使得害蟲(chóng)在進(jìn)食后難以實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，最終導(dǎo)致害蟲(chóng)的死亡。相較于Bt晶體蛋白毒素基因，物蛋白酶抑制劑具有應(yīng)用范圍廣且不易生成抗藥性等優(yōu)勢(shì)，其中，1994年，Parrot等研究者已成功將物蛋白酶抑制劑導(dǎo)入大豆之中。

綜上所述，大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、大豆抗病毒基因的應(yīng)用，相信在先進(jìn)技術(shù)支持下，大豆抗病蟲(chóng)害能力將大幅度提升，其育種效果將更加顯著。

（作者單位：164135 沈陽(yáng)聯(lián)勤保障中心龍鎮(zhèn)農(nóng)副業(yè)基地）