山雞椒LcGPPS表達模式及其與LcGGPPS蛋白互作分析

曹 佩，陳益存，高 暝， 郭浩波， 汪陽東*

(1．中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400； 2．美國田納西大學生物化學系，田納西州 諾克斯維爾TN 37996)

山雞椒LcGPPS表達模式及其與LcGGPPS蛋白互作分析

曹 佩1，陳益存1，高 暝1， 郭浩波2， 汪陽東1*

(1．中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400； 2．美國田納西大學生物化學系，田納西州 諾克斯維爾TN 37996)

目的鑒定與山雞椒精油合成關鍵酶香葉基二磷酸合酶(LcGPPS)的互作蛋白，為揭示山雞椒精油主要成分單萜物質的合成機理奠定基礎。方法通過本地Blast搜索山雞椒果實轉錄組數據庫，采用RT-PCR克隆山雞椒GPPS基因(編碼異質GPPS小亞基的LcGPPS.SSU1)和山雞椒GGPPS基因(LcGGPPS1和LcGGPPS3)；利用qRT-PCR分析其組織特異性表達模式，通過蛋白互作預測和酵母雙雜實驗驗證LcGPPS.SSU1分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作關系。結果克隆得到LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3 3條基因序列，基因表達模式分析表明，LcGPPS.SSU1特異性地在花和果實中高水平表達；蛋白結構互作預測結果顯示，LcGPPS.SSU1可以分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3互作形成異質二聚體；經過酵母雙雜交實驗驗證發現，僅LcGGPPS3能與LcGPPS.SSU1發生互作。結論LcGPPS.SSU1通過與LcGGPPS3蛋白發生互作從而在山雞椒萜類合成途徑中發揮作用，為深入研究山雞椒萜類合成機制提供參考。

山雞椒；萜類合成；GPPS；GGPPS；異質二聚體；蛋白互作；表達模式

香葉基焦磷酸合酶(GPPS)是調控萜類化合物生物合成途徑中調控節點行使作用的關鍵酶，催化底物C5前體異戊烯基二磷酸酯(IPP)及其異構體二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)合成單萜前體香葉基焦磷酸GPP，競爭性地將底物流導向單萜合成，為單萜的合成提供了基本的碳骨架，也為后續各種化合物的形成提供了基礎[1]。GPPS在單萜合成過程中起著關鍵作用，參與防御反應、吸引傳粉等生理生化過程，在植物生長發育中不可或缺[2]。

GPPS在自然界中以異質二聚體和同質二聚體的形式存在，均以催化合成GPP為唯一產物[3]。同質二聚體GPPS由2個相同亞基，由GPPS基因編碼組成，在自然界中廣泛存在[4]，目前已從裸子植物和被子植物中分離、鑒定出GPPS基因[5-6]；而異質二聚體GPPS則由一大一小2個亞基組成，分別由大亞基GPPS.LSU和小亞基GPPS.SSU編碼。GPPS.LSU是一類異戊烯基轉移酶類似蛋白(prenyltransferase，PTS-like protein)，通常與負責催化合成二萜化合物前體香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的香葉基香葉基焦磷酸合酶(GGPPS)有70%的序列相似性[7-8]，同時，GGPPS也可以充當大亞基搭檔，與小亞基形成異質二聚體GPPS，催化生成GPP，從而調節代謝底物轉向單萜物質的合成[9]。目前，GPPS.LSU的研究主要是觀察其單獨表達是否有活性，能否與GPPS.SSU互作，以及與GPPS.SSU共表達后的催化活性。文獻報道僅從少數幾種植物中克隆出GPPS.LSU，包括薄荷(MenthapiperitaL.)MpGPPS.LSU、啤酒花(HumuluslupulusL.)HlGPPS.LSU、金魚草(AntirrhinummajusL.)AmGPPS.LSU和長春花(Catharanthusroseus(L.) G. Don.)CrGPPS.LSU等，其中，MpGPPS.LSU和HlGPPS.LSU單獨表達時均沒有活性，AmGPPS.LSU單獨表達時具有GGPPS催化活性，CrGPPS.LSU單獨表達時具有GPPS和GGPPS的雙催化活性[6-7,9-10]。

山雞椒(Litseacubeba(Lour.) Pers.)又名山蒼子、木姜子，多年生落葉小喬木，屬樟科(Lauraceae)木姜子屬(LitseaLam.)，廣泛分布于我國長江以南，資源豐富。山蒼子的根、葉和果實中均含有精油，其中以果實中含量最高，高達85%左右[11-12]。精油中的成分主要是單萜和倍半萜化合物，其主要成分檸檬醛更是合成紫羅蘭酮系列名貴香料的主料[13]；然而，目前我國的山雞椒主要以野生資源為主，精油產量和品質受環境影響較大[12]，為培育優良品種，提高山雞椒精油產量，改善精油品質，迫切需要探究山雞椒體內單萜合成的調控機制。目前，關于山雞椒體內萜類合成途徑的研究甚少，僅有LcDXR、LcTPS1、LcTPS2和LcTPS3被克隆驗證[14-15]，而GPPS作為單萜合成途徑的關鍵節點，在山雞椒中尚無文獻報道。因此，本研究以山雞椒的幼果以及各組織為試驗材料，分析了LcGPPSs與LcGGPPSs的表達模式，并克隆了LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3基因，對蛋白之間的互作進行探索驗證，以期為山雞椒果實中單萜的形成和調控機制研究提供理論參考，為提高精油產量和品質的遺傳育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

所采用的山雞椒植株新鮮組織(花、花芽、葉芽、嫩葉、莖、果實和根等)，采自浙江杭州市富陽區中國林科院亞熱帶林業研究所黃公望森林公園內，采后迅速置于液氮中，帶回實驗室保存在-80℃冰箱，留于后續實驗。

1.2 數據來源

由于GPPS.LSU已鑒定的物種較少，且與GGPPS具有較高的相似性，為了獲得更全面的序列，作者在山雞椒的果實轉錄組數據庫(NCBI登錄號：SRA080286)中分別利用擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)GGPPS11(NM_113869)和薄荷MpGPPS.LSU(AAF08792)核苷酸序列，以1×10-5為臨界值，搜索相似序列，將得到的候選序列經過尋找編碼框(ORF Finder, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，翻譯成氨基酸序列后經BLASTP分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，保守域分析驗證(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，共得到10條目的序列。

1.3 山雞椒總RNA的提取及cDNA合成

采集山雞椒的花、花芽、葉芽、嫩葉、莖、果實和根等組織，總RNA提取采用EASYpin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)。利用美國Invitrogen公司反轉錄試劑盒SuperScriptⅢⅠst Strand cDNA合成第一鏈cDNA，用于后續qRT-PCR分析和基因克隆實驗。

1.4 LcGPPSs和LcGGPPSs的表達分析

采用qRT-PCR分析LcGPPSs和LcGGPPSs基因在正常生長的山雞椒不同組織間和果實發育過程中的表達模式。在4條序列的保守區域至非保守區域設計引物，測序驗證，以微管蛋白α基因(TUA)為內參基因，檢測山雞椒不同部位這10個基因的表達水平，具體操作步驟按SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa, Tokyo, Japan)說明書進行。以滅菌雙蒸水為模板作為空白對照，在Applied Biosystems Prism 7300儀器(ABI，美國)上進行，目的基因相對表達水平利用2-△△Ct方法計算，所有反應均為2次生物學重復，4次技術性重復。qRT-PCR程序如下：95℃ 30 s 1個循環，95℃ 5 s、60℃ 31 s, 35個循環。用于這10條基因的qRT-PCR引物見表1。

表1 用于表達模式分析的10條基因的qRT-PCR引物及登錄號

1.5 LcGPPS和LcGGPPSs基因的克隆

根據LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3的序列信息，分別在其開放閱讀框上、下游設計特異性引物，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase mix(TakaRa)擴增cDNA序列。將獲得的PCR產物連接于pClone007載體上，并送到測序公司(北京擎科新業生物技術有限公司，杭州)進行測序。用于擴增這3條基因的引物見表2。

1.6 LcGPPS和LcGGPPSs的序列分析、進化分析以及結構預測

利用ExPaSy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線計算蛋白質的分子質量和理論等電點等基本信息，運用I-TASSER v4.3對LcGPPS和LcGGPPSs的高級結構進行預測與分析[16]，多序列比對使用Clustalx、DNAMAN、Bioedit等軟件；采用鄰接算法(NJ)，使用MEGA 4.0軟件構建進化樹，bootstrap檢測設置重復為1 000次。

1.7 誘餌質粒與捕獲質粒的構建

根據LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3序列分別設計上、下游帶質粒酶切位點引物(表2)PrimeSTAR Max DNA Polymerase酶用于PCR擴增，PCR反應程序：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸60 s，33個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。同時分別用EcoRI/PstI雙酶切pGBKT7載體，EcoRI/BamHI、NcoI/BamHI雙酶切pGADT7載體，37℃孵育2 h，酶切結束后1%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，利用無縫克隆，連接酶切后的載體和目的片段，轉化大腸桿菌DH5α，分別經卡那霉素抗性和氨芐霉素抗性篩選，挑選陽性轉化子，提取質粒，PCR酶切驗證后，由公司測序驗證。

表2 LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3的登錄號和引物

1.8 誘餌質粒的毒性和自活性驗證以及捕獲質粒的假陽性檢測

1.9 酵母共轉化及陽性克隆的鑒定

以共轉化pGBKT7-53質粒和pGADT7-T到Y2HGold菌株作陽性對照實驗，共轉化pGBKT7-Lam質粒和pGADT7-T到Y2HGold菌株中做陰性對照實驗，將pGADT7-L1質粒、pGADT7-L3質粒分別和pGBKT7-SUl質粒共轉化到Y2HGold菌株中，分別在DDO/X、DDO/ X /A、QDO/X/A固體培養基上培養，觀察菌落的生長情況。

2 結果與分析

2. 1 LcGPPSs和LcGGPPSs家族基因成員的克隆與表達模式分析

在山雞椒的果實轉錄組數據庫中，共搜索得到10條目標序列，其中,3條LcGPPS.SSU序列，分別命名為LcGPPS.SSU1、LcGPPS.SSU2和LcGPPS.SSU3；7條LcGPPS.LSU序列，由于其與LcGPPS.SSU蛋白的互作關系未知，暫且命名為LcGGPPS1-7。萜類物質是植物重要的次生代謝物，尤其是單萜物質更是植物與環境交流的媒介，為了探尋LcGPPS.SSU及其可能的搭檔在山雞椒體內的作用，利用熒光定量PCR，對LcGPPS.SSUs與LcGGPPSs在山雞椒果實發育過程和不同組織中的表達模式進行了探究，結果見圖1、2。來自LcGPPS.SSUs家族的3個基因展現了2種表達模式，其中,LcGPPS.SSU2和LcGPPS.SSU3具有相似的表達模式，在山雞椒果實的發育過程中，不僅在前中期呈現了一個表達高峰，而且在果實發育后期表達量又有提升，而且兩基因在不同組織中也表現出相似的特征，都在幼果中具有較高的表達，其次是花和花蕾，然后是葉芽和根，在莖中的表達量最少，不同的是LcGPPS.SSU2整體表達量較高，LcGPPS.SSU3在花中的特異性更加明顯。LcGPPS.SSU1擁有不同的表達模式，特異性地在花、花蕾和果實中表達，而且在果實發育前中期呈現了一個顯著的表達高峰，其最高表達量達到LcGPPS.SSU2的5倍，達到LcGPPS.SSU3最高表達量的40倍；所以，在LcGPPS.SSUs基因家族中，作者挑選表達量最高且特異性表達的LcGPPS.SSU1作為研究對象。

來自LcGGPPSs家族的7條基因表達模式各不相同，在山雞椒果實發育過程中，LcGGPPS2、LcGGPPS4和LcGGPPS5在前中期出現了表達高峰，LcGGPPS3和LcGGPPS7的表達高峰則出現在果實發育后期，而LcGGPPS1在前中期和后期都出現了表達高峰，LcGGPPS6在過程中無明顯規律。在不同組織中的表達顯示，LcGGPPS3-7雖然表達量各不相同，但在花和花蕾中的表達量都顯著高于其它組織，LcGGPPS1除了在莖中表達量較低外，在其它組織中的表達量相差不大，LcGGPPS2則顯示了在果實、根、花和花蕾中的特異性，說明在LcGGPPSs家族中，LcGGPPS1參與較多組織中萜類物質的生成，LcGGPPS2主要在果實、根與花中發揮作用，而LcGGPPS3-7主要在花發育過程中參與萜類物質的合成，在其它部位作用較少。作者挑選分別代表2種表達模式的LcGGPPS1和LcGGPPS3，探究可能與LcGPPS.SSU1的大亞基搭檔。

LcGPPS.SSU1的表達量位于左邊主坐標軸上，其余9條基因的表達量位于次坐標軸上。 LcGPPS.SSU1 was exhibited in primer axis, and the rest genes were exhibited in second axis.圖1 LcGPPS.SSUs和LcGGPPSs在山雞椒果實發育過程中的表達模式Fig.1 The expression patterns of LcGPPS.SSUs and LcGGPPSs in fruits maturation

圖中共包含9條基因，LcGPPS.SSU1由于表達量過高，未在圖中顯示；FB：花芽；LG：葉芽；F：花；S：莖；R：根；FL：幼果。LcGPPS.SSU1 was absent because of extremely high expression level. The tissues tested includes flower bud (FB), leafbud (LB), flower (F), steam (S), root (R) and fruitlet (FL).圖2 LcGPPS.SSUs和LcGGPPSs在山雞椒不同組織中的表達模式Fig.2 The expression patterns of LcGPPS.SSUs and LcGGPPSs in different tissues in L. cubeba

2.2 LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3的克隆

利用PCR對LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3進行擴增，PCR產物經過1% 的瓊脂糖電泳之后，分別檢測到3條不同大小的條帶(圖3)，序列測序結果與轉錄組電子序列一致。在NCBI中BLASTP結果顯示，LcGPPS.SSU1與來自芍藥(Paeonialactiflora，AKJ26303)的GPPS.SSU具有50%的相似性，LcGGPPS1和LcGGPPS3分別與來自歐洲榛(Corylusavellana，ABW06960.1)和葡萄(Vitisvinifera，XP_002273789.1)的GGPPS展現73%與60%的相似性。分別將以上3條基因提交至NCBI數據庫。登錄號與所用引物見表2。

圖3 LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3家族基因ORF擴增產物Fig. 3 The PCR amplification product of ORF of LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1 and LcGGPPS3

2.3 LcGPPS.SSU1分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作探究

在單萜的合成過程中，異質二聚體GPPS起著顯著的作用，在金魚草和啤酒花里，GPPS.SSU的表達量與單萜的釋放緊密相關[6,10]，異質二聚體結構里的大亞基通常由特定的LSU或者一些GGPPS蛋白來扮演，但并不是所有的GGPPS都能充當大亞基[7]。目前，LSU與GGPPS的界定只能通過催化活性的有無及能否與GPPS.SSU互作來鑒別，通過氨基酸序列以及三維結構上關鍵位點來判別，目前只在少數物種中實現，尚未在大多數物種中得到驗證。作者利用三維結構預測和酵母雙雜互作驗證對山雞椒LcGGPPS1和LcGGPPS3能否與LcGPPS.SSU1互作進行了探索。

2.3.1 LcGPPS.SSU1和LcGGPPSs蛋白結構及互作預測 以薄荷異質GPPS晶體結構(PDB entry: 3KRO)為參照，作者利用I-TASSER v4.3對LcGPPS.SSU1分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3的晶體互作結構進行了互作預測。LcGGPPS1/3與LcGPPS.SSU1的三維模型主要由α-螺旋組成，以無規則卷曲和轉角等連接，LcGGPPS1/3與LcGPPS.SSU1能分別覆蓋到薄荷異質二聚體大小亞基的三維結構上，也就是說晶體結構預測LcGGPPS1與LcGGPPS3都能與LcGPPS.SSU1互作，構成異質二聚體GPPS，由于LcGGPPS1與LcGGPPS3的結構相似，圖4中以LcGGPPS1與LcGPPS.SSU1的互作結構為例。

2.3.2 酵母雙雜驗證LcGPPS.SSU1的互作蛋白

2.3.2.1 誘餌質粒的毒性和自活性驗證以及捕獲質粒的假陽性檢測 Y2HGold-pGBKT7-SU1在SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A固體培養基上的觀察結果(圖5)顯示：該菌株沒有自激活，沒有毒性，說明pGBKT7-SU1可以作為誘餌蛋白用于互作驗證。pGBKT7原型質粒與pGADT7-L1共轉化Y2HGold，在DDO/X、DDO/X /A、QDO/X/A上的培養結果顯示：pGADT7-L1質粒沒有發生自激活，沒有產生假陽性。pGBKT7原型質粒與pGADT7-L3的共轉化培養結果顯示：pGADT7-L3也沒有發生自激活和假陽性。

圖4 LcGPPS.SSU1(紅色)與LcGGPPS1(橙色)的二聚體結構Fig. 4 Dimeric structures of LcGPPS.SSU1(red) and LcGGPPS1(orange)

2.3.2.2 pGBKT7-SU1分別與pGADT7-L1和pGADT7-L3的酵母雙雜結果 以共轉化pGBKT7-53質粒和pGADT7-T到Y2HGold菌株作陽性對照，共轉化pGBKT7-Lam質粒和pGADT7-T到Y2HGold菌株中做陰性對照，將pGBKT7-SU1和pGADT7-L1共轉化Y2HGold。培養結果(圖6)顯示：在DDO/X平板上出現明顯藍色菌落，說明編碼a半乳糖苷酶的MEL1報告基因已被激活，其分泌的a半乳糖苷酶能與培養基中的X-a-gal相互作用而使菌落呈現明顯的藍色，但是在DDO/ X /A和QDO/X/A平板上并沒有長出菌落，說明二者表達的蛋白之間沒有互作，轉化菌株沒有獲得AbA抗性。pGBKT7-SU1與pGADT7-L3共轉化Y2HGold，培養結果(圖6)顯示：在3種平板上都長有菌落，但與陽性克隆在相同平板上的表現相比，長出的菌落較少且著色較淺，說明pGBKT7-SU1與pGADT7-L3質粒表達的蛋白雖然存在互作，但作用強度較弱。

A：Y2HGold-pGBKT7-SU1菌株自激活及毒性檢測；B：pGADT7-L1質粒假陽性驗證；C：pGADT7-L3質粒假陽性驗證。A: Testing Bait Y2HGold-pGBKT7-SU1 for autoactivation and toxicity; B: Eliminating false positive of pGADT7-L1; C: Eliminating false positive of pGADT7-L3.圖5 誘餌質粒自激活驗證及捕獲質粒假陽性驗證Fig.5 Verification of Y2HGold-pGBKT7-SU1 for autoactivation and toxicity and false positive for pGADT7-L1 and pGADT7-L3

圖6 LcGPPS.SSU1分別和LcGGPPS1與LcGGPPS3的蛋白互作驗證以及陰性和陽性對照Fig.6 Verifying of the proteins interactions between LcGPPS.SSU1and LcGGPPS1/3 and negative and positive control

2.4 LcGPPS.SSU1與LcGGPPSs的系統進化分析

編碼GPPS和GGPPS關鍵酶的基因已經從數十種植物中分離出來，利用鄰接法(NJ)，對山雞椒LcGPPS.SSU1和LcGGPPSs及一些植物GPPS/GGPPS蛋白進行系統進化分析。圖7表明：43條蛋白序列清楚地分成3類(圖中所包含的序列及登錄號見表3)，其中：SSUII與GGPPS聚成一大類，說明SSUII與GGPPS的相似性更高；SSUI單獨聚成一小類，LcGPPS.SSU1聚類到SSUI里，同在這一類的多來自芳香植物，其中包含來自丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的SmGPPS.SSUI, LcGPPS.SSU1的表達模式也與SSUI的特征相同，主要表達在單萜的儲藏與釋放器官[6,9]。在SSUII分類中，包含擬南芥的AtSSU(即AtGGPPS12)和來自丹參的 SmGPPS.SSUII1和SmGPPS.SSUII2，說明一個物種中可能同時含有兩類GPPS.SSU，其分類可能與功能的分化有關，而不是之前報道的根據物種分類。在GGPPS這一類中，可以看到主要包括兩大類，分別由來自被子植物和裸子植物的GGPPS蛋白組成，其中,裸子植物分類中含有2條來自被子植物的蛋白序列，分別是丹參和麻風樹(JatrophacurcasL.)；在被子植物分類中，又分出若干小的類別，而已克隆并鑒定活性的4條LSU序列聚成一個小類，說明LSU起源于GGPPS，并且已經進化出了特定的功能，與其它的GGPPS親緣關系較遠，LcGGPPS3不僅沒有聚到LSU分類中，還與SmGGPPS3一起聚類到裸子植物與被子植物的GGPPS之外，說明其與大多數的GGPPS蛋白親緣關系較遠，其起源可能要早于裸子植物與被子植物的分化。

圖7 山雞椒與其它物種GPPS/GGPPS系統進化分析Fig.7 Phylogenetic relationship between L. cubeba and other plants GPPS/GGPPS families

序號No．縮寫Abbreviationinthetree物種Species登錄號Accessionnumber序號No．縮寫Abbreviationinthetree物種Species登錄號Accessionnumber1EuGGPPSElaeagnusumbellataACO5990521LiSSULavandulaintermediaAGH33891．12TkGGPPSTaraxacumkok?saghyzALJ30146．122AtSSUArabidopsisthalianaAAG40013．13PbGGPPSPlectranthusbarbatusALE19959．123GmSSUGlycinemaxNP＿001238613．14PmGGPPSPinusmassonianaAGU43761．124MsSSUMedicagosativaAEL29573．15JcGGPPSJatrophacurcasNP＿001295715．125VvSSUVitisviniferaXP＿0022780236CaGGPPSCorylusavellanaABW06960．126OsSSUOryzasativaEAY87007．17TcGGPPSTaxuscanadensisAAD16018．127HbSSUHeveabrasiliensisBAF983008MtGGPPSMedicagotruncatulaXP＿003629488．128AgGPPS2AbiesgrandisAAN01134．19MsGGPPSMedicagosativaADG0184129AgGPPS1AbiesgrandisAAN01133．110GbGGPPSGinkgobilobaAAQ72786．130AgGPPS3AbiesgrandisAAN01135．111NaGGPPSNicotianaattenuataABQ53935．131SmGPPS．SSUISalviamiltiorrhizaJN83110812CrGPPS．LSUCatharanthusroseusAGL91645．132SmGPPS．SSUII．1SalviamiltiorrhizaJN83110913MpGPPS．LSUMenthapiperitaAAF08793．133SmGPPS．SSUII．2SalviamiltiorrhizaJN83111014AmGPPS．LSUAntirrhinummajusAAS82860．134SmGGPPS1SalviamiltiorrhizaFJ64361715SmGPPS．LSUSalviamiltiorrhizaAEZ55681．135SmGGPPS2SalviamiltiorrhizaJN83111216MpSSUMenthaxpiperitaAAF08792．136SmGGPPS3SalviamiltiorrhizaJN83111317HlSSUHumuluslupulusACQ90681．137AtGGPPS2ArabidopsisthalianaNM＿127943．218LcSSULeucosceptrumcanumALT07956．138AtGGPPS11ArabidopsisthalianaNM＿113869．119CbSSUClarkiabreweriAAS82870．139CsGGPPSCrotonsublyratusBAA86284．120AmSSUAntirrhinummajusAAS82859．140AgGGPPSAbiesgrandisAAL17614．2

3 討論

根據文獻報道，Chang等[7]為驗證異質MpGPPS的催化活性，在底物結合與催化區域挑選3個氨基酸殘基，構建了[LSU(D83A/D84A/D89A)·SSU]2突變體，發現突變體完全沒有活性，證實異質GPPS的催化活性是由MpLSU大亞基行使；而通過晶體結構解析發現，MpSSU通過R loop限制住MpLSU的移動，并通過催化活性腔構象的改變影響底物的結合以及產物的變化，從而改變催化的特異性，說明異質二聚體GPPS中，LSU負責催化，SSU負責調節。在金魚草和薄荷中，其單萜釋放量與GPPS.SSU組織時空表達水平呈相關，與GPPS.LSU表達無相關性，說明SSU在單萜的合成過程中可能起關鍵的作用[7,10]，Orlova等[17]將本身不具有催化活性的金魚草AmSSU在煙草中超表達，結果也獲得了單萜釋放量增加，提示外源AmSSU可以與系統進化上較遠的煙草GGPPS互作，并改變了其催化特異性，調節底物轉向單萜合成方向。此外，早期研究發現，茉莉酸甲酯處理能夠通過刺激轉錄因子進而調控萜類積累相關的酶基因的表達[18]。Avanish等[9]用茉莉酸甲酯處理長春花的葉子，結果發現顯著誘導了CrGGPPS.SSU的表達，說明GPPS.SSU能夠通過轉錄因子響應外界刺激，找到能與之互作的GGPPS并改變其催化活性從而改變代謝底物轉向單萜合成，生成與防御、化感以及繁殖相關的單萜物質。

系統進化分析結果顯示，GPPS.LSU起源于GGPPS，已經與GGPPS蛋白展現出一定的遺傳距離，聚成一個單獨的類別，說明在與GPPS.SSU的互作過程中，GPPS.LSU出現了選擇性進化。結合山雞椒中3條序列的系統進化分析，LcGGPPS3不僅不屬于LSU類別，且與大部分GGPPS和LSU蛋白距離較遠，但LcGGPPS3能與LcGPPS.SSU1互作，說明GPPS.SSU不僅能與LSU互作，也能與部分GGPPS互作，但這部分GGPPS作者通過系統進化分析并不能辨別。

Chang等[7]從晶體結構角度對大小亞基之間的互作進行解析，根據薄荷GPPS，(LSU·SSU)2異四聚體的晶體結構，比較來自白芥(SinapisalbaL.)同型二聚體GGPPS與MpGPPS.LSU的序列發現，在大小亞基互作界面A上存在4個氨基酸殘基與二聚體形成的性質有關，在SaGGPPS結構里，這4個氨基酸通過與另一個相同亞基氨基酸之間的作用力來穩定結構，但在MpGPPS.LSU結構里，這4個氨基酸被替換，當MpGPPS.LSU形成同型二聚體時，相互之間的作用力消失或者產生相排斥的力，造成同型二聚體結構不夠穩定，認為這可能是MpGPPS.LSU更傾向于形成異質二聚體而不是同型二聚體的原因，但通過對比到山雞椒LcGGPPS3，作者發現這一規律并不完全符合，而來自金魚草的AmGPPS.LSU不僅能與AmGPPS.SSU互作，而且單獨表達時還具有GGPPS催化活性，說明GGPPS與LSU蛋白之間的界定并不是嚴格的非此即彼，結合Mp異四聚體的晶體結構，作者發現上面討論的4個關鍵氨基酸只是位于互作界面的一條螺旋結構上，互作界面還包括另外3條螺旋結構，說明界面上還存在更多的氨基酸殘基之間的作用力來維持穩定的結構。

作者的實驗結果表明，LcGPPS.SSU1與LcGGPPS3 二者在山雞椒果實成熟過程中也呈現相似的表達模式，并且LcGPPS.SSU1通過與LcGGPPS3蛋白互作從而在山雞椒精油單萜合成中發揮作用。另外，LcGGPPS3雖然能與LcGPPS.SSU1互作，但實驗顯示互作不是很強，提示可能還存在其它的GGPPS或特定的LSU能與LcGPPS.SSU1互作，也就是說LcGPPS.SSU1可能互作的搭檔不止一個。在LcGGPPS家族中，每一條基因的表達模式都不相同，但具體分工還需要試驗的進一步驗證。LcGPPS.SSU1與LcGGPPS3的互作為研究山雞椒精油中單萜合成的機制提供了基礎。

4 結論

本研究中，分離克隆得到了LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3基因，其中LcGPPS.SSU1特異性地在山雞椒花和果實中呈現高表達水平，在山雞椒果實發育過程中，LcGGPPS3呈現出與LcGPPS.SSU1相似的表達趨勢，酵母雙雜交實驗證實，LcGGPPS3可以與LcGPPS.SSU1互作，從而在山雞椒精油單萜合成中發揮作用。

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GeneExpressionPatternofLcGPPSandItsInteractionwithLcGGPPSsinLitseacubeba

CAOPei1,CHENYi-cun1,GAOMing1,GUOHao-bo2,WANGYang-dong1

(1. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400, Zhejiang, China;2. Department of Biochemistry, University of Tennessee, Knoxville TN 37996, Tennessee, USA)

ObjectiveTo identify the interacted proteins of geranyl diphosphate synthase (GPPS) and provide theoretical bases for illuminating the mechanism of monoterpene biosynthesis inLitseacubeba.MethodThe transcriptome database of fruits ofL.cubebawas searched by basic blast tool. RT-PCR was used to cloneGPPSgenes (LcGPPS.SSU1 encoding the small subunit of heteromeric GPPS) andGGPPSgenes (LcGGPPS1 andLcGGPPS3). qRT-PCR was conducted to analyze the expression patterns. In addition, prediction of three-dimensional structure models and yeast two-hybrid system were used to verify the protein interaction.ResultLcGPPS.SSU1,LcGGPPS1 andLcGGPPS3 were cloned. The expression pattern analysis showedLcGPPS.SSU1 specifically expressed in flower, flower bud and fruit in a significant high level. The prediction of protein interaction showed that both LcGGPPS1 and LcGGPPS3 could interact with LcGPPS.SSU1, while the result of yeast two-hybrid system showed that only LcGGPPS3 can interact with LcGPPS.SSU1.ConclusionLcGPPS.SSU1 can interact with LcGGPPS3 to form heterodimer to function in the terpenoids biosynthesis inL.cubeba, which provides knowledge for addressing the mechanism of terpenoids biosynthesis pathway inL.cubeba.

Litseacubeba; terpenoids biosynthesis; GPPS; GGPPS; heterodimer; protein interaction; expression pattern

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.024

2017-02-13

國家自然科學基金項目(31370576)

曹 佩(1992—)，女，河南信陽人，碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種.

* 通訊作者：汪陽東，研究員，博士，研究方向為林木遺傳育種與分子生物學.E-mail:Wyd11111@126.com

S718.46

A

1001-1498(2017)06-1050-09

金立新)