植物乳桿菌FCJX 102和嗜酸乳桿菌FCJX 104共發酵山楂-葛根汁產乙醛脫氫酶

羅成，萬茵*，付桂明,3，張鴻婷,3，郭帥玲,3，童火艷,3，郭德斌

1(南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)2(南昌大學 食品學院，江西 南昌，330047)3(南昌大學，中徳食品工程中心，江西 南昌，330047)4(江西煌上煌集團有限公司，江西 南昌，330052)

植物乳桿菌FCJX102和嗜酸乳桿菌FCJX104共發酵山楂-葛根汁產乙醛脫氫酶

羅成1,2，萬茵1,2*，付桂明1,2,3，張鴻婷1,2,3，郭帥玲1,2,3，童火艷1,2,3，郭德斌4

1(南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)2(南昌大學 食品學院，江西 南昌，330047)3(南昌大學，中徳食品工程中心，江西 南昌，330047)4(江西煌上煌集團有限公司，江西 南昌，330052)

從短乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌中篩選出產乙醛脫氫酶的植物乳桿菌LactobacillusplantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophiluFCJX 104。在單因素實驗的基礎上，以山楂葛根比、菌種比、發酵時間為影響因子，對產乙醛脫氫酶發酵條件進行正交實驗優化。優化后在培養基中山楂葛根質量比為1∶2，菌種L.plantarumFCJX 102與L.acidophiluFCJX 104比為2∶1時，在37 ℃下培養16 h，獲得的乙醛脫氫酶活力最高可達16.083 U/g。

山楂葛根汁；植物乳桿菌；嗜酸乳桿菌；乙醛脫氫酶

國內外學者研究表明，乳酸桿菌可產生膽固醇氧化酶，將膽固醇氧化成膽固烯酮[1-2]；同時大量實驗表明乳酸桿菌能產生SOD等抗氧化活性物質，可有效清除DPPH自由基，減輕肝臟損傷[3-4]，達到護肝的目的。在人體內，乙醇的代謝主要包括乙醇脫氫酶(ADH)催化的乙醇氧化體系和乙醛脫氫酶(ALDH)催化的乙醛氧化體系[5]。其反應方程式簡述如下：

乙醇在被人體吸收后，首先在乙醇脫氫酶(ADH)的催化作用下被脫氫氧化，轉化為乙醛。生成的乙醛又在乙醛脫氫酶(ALDH)的催化作用下被氧化為乙酸，乙酸進入三羧酸循環最終被分解為水和二氧化碳被排除體外[6]。由于遺傳或突變等原因，不同人體內ALDH或者有活性的ALDH的含量有著顯著差異[7]，ALDH活性較低時，乙醛的降解速度低于其生成速度，乙醛在體內不斷積累，通過血腦屏障刺激小腦，產生惡心欲吐、昏迷不適等醉酒癥狀。乙醛本身還是一種潛在的致癌物，長期受到乙醛刺激會提高口腔、食道、肝等部位癌變的風險[8]。目前市面上出售的解酒藥主要原理是通過其中所含有的提取物有效成分作用于肝臟，激活人體內的乙醛脫氫酶，從而達到解酒效果，而以具有高活性的乙醛脫氫酶作為解酒藥主要成分的商品卻鮮有見到。工業化的乙醛脫氫酶都提取自動物的胰腺、肝臟或肝細胞線粒體中，來源的局限性致其價格居高不下。微生物中產乙醛轉移酶的有釀酒酵母和醋酸菌，尚未見產乙醛轉移酶的乳酸菌的研究報道。

山楂、葛根是兩種藥食同源的保健性中草藥，常用于保健食品中。現代研究表明，山楂、葛根含有多種人體必需的礦物質、氨基酸、維生素及黃酮等，具有治療心腦血管疾病、預防動脈硬化、抗氧化等多種藥理作用。此外，多篇研究報道，山楂、葛根可用于醒酒護肝。如葛根在中國古代《本草拾遺》中謂其“解酒毒”良品，葛根素和大豆苷元是葛根異黃酮類化合物中的主要成分，具有抗氧化、解酒保肝多種藥理作用[9]。山楂有開胃消食、活血化瘀之功效，山楂黃酮和多酚有較強的清除自由基的能力，常用于治療肝損傷[10]。本研究從5種乳酸菌菌株中篩選產乙醛脫氫酶的乳酸菌菌株，以其為發酵菌種發酵山楂-葛根汁，并對產乙醛脫氫酶發酵條件進行了正交優化，為山楂葛根乳酸菌發酵醒酒產品開發生產提供理論依據。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

山楂，湖北蘄春中藥材公司；葛根，江西橫峰皇同有機葛開發有限公司。

NAD(生物試劑，Roche公司)；HCl(國產優級純)；濃H2SO4、蒽酮、乙醇、HaOH、EDTA、Tris、KCl、乙醛、β-巰基乙醇、NaH2PO4、Na2HPO4，均為國產試劑分析純。

1.2 菌株

短乳桿菌LactobacillusbrevisFCJX 103、植物乳桿菌LactobacillusplantarumFCJX 102、副干酪乳桿菌LactobacillusparacaseiFCJX 105由江西農業大學徐波副教授實驗室贈予，嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophiluFCJX 104、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusFCJX 101、釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeFCJX 503、醋酸菌AcetobactercalcoaceticusFCJX 901為本實驗室保藏菌種。

1.3 培養基

乳酸菌種子培養基、發酵培養基：MRS培養基。

醋酸菌液體培養基：葡萄糖20.0 g，酵母浸粉4.0 g，水1 000 mL，pH 6.8，115 ℃滅菌30 min，冷卻，在無菌室中加入95%乙醇4 mL。

1.4 儀器設備

T6型紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JY92-2D超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；SORVALL高速冷凍離心機，ThermoFisher公司；DKS-24型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫療儀器有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；HJ-4A型數顯四聯磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；SG3300H超聲波清洗儀，上海冠特超聲儀器有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；JA5003電子天平、FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 產乙醛脫氫酶乳酸菌的篩選

1.5.1.1 比濁法測菌種生長曲線

將短乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌5種乳桿菌在MRS培養基中進行培養，每隔2 h取樣，并在600 nm下測定OD值，繪制5種菌種的生長曲線。

1.5.1.2 產乙醛脫氫酶活力測定方法[11]

比色皿中加入2.52 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH=8.0)、0.1 mL EDTA溶液(0.05 mol/L)、0.1 mL KCl溶液(3 mol/L)、0.1 mL NAD+溶液(0.02 mol/L)、0.05 mL乙醛溶液(0.1 mol/L)、0.03 mL β-巰基乙醇溶液(0.05 mol/L)，混勻后，加入0.1 mL樣液，迅速混勻后，于340 nm波長下測吸光值，計算5 min內吸光值的變化ΔA340。

酶活力單位定義：25 ℃下，每分鐘催化還原1 μmol NAD+所需要的酶量為1個酶活力單位。

1.5.1.3 產乙醛脫氫酶乳酸桿菌篩選

分別將5種乳桿菌接種于MRS培養基中，接種量為5%(5×107CFU/mL)，37 ℃恒溫靜置培養16 h。釀酒酵母S.cerevisiaeFCJX 503、醋酸菌A.calcoaceticusFCJX 901作為陽性對照，接種量為5%，在各自適宜培養基中恒溫培養16 h。7株菌的發酵液經4 500 r/min、4 ℃離心15 min后，沉淀用滅菌生理鹽水洗滌2次，收集菌泥，再將菌泥和磷酸鹽緩沖液(pH 8.0，20 mmol/L)以1∶5的比例制成菌懸液，冰浴中以200 W功率超聲破碎15 min，再于6 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液，沉淀再同樣超聲處理1次，合并2次上清液即得酶樣液，用1.5.1.2方法測得乙醛脫氫酶活性。選出具有產酶能力的菌種進行后續實驗。

1.5.2 山楂-葛根原汁制備

1.5.2.1 原料預處理

將葛根粉碎至20目，加入5倍質量的水，并添加0.1%的耐高溫α-淀粉酶，于100 ℃下酶解液化50 min，100目過濾，收集濾液作為葛根汁；將鮮山楂按1∶1的比例加水榨漿，向山楂原漿中加入0.5 g/L果膠酶(10萬U/g)，在溫度50 ℃、pH 為3.5的條件下酶解4 h，加入0.5 g/L殼聚糖沉淀，再經過硅藻土過濾，得山楂原料汁(質量分數為50%)。

1.5.2.2 不同比例山楂-葛根汁的配制

按山楂 ∶葛根質量比為3∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶3，分別進行原料預處理，將處理后的山楂汁、葛根汁混合即得不同比例的山楂-葛根汁。

1.5.3 發酵條件優化

1.5.3.1 不同山楂葛根比對雙乳桿菌產ALDH的影響

環境因素，尤其是培養基成分對菌體的生長和產酶有重要影響。本研究通過改變兩種原料的配比，探究不同山楂葛根比對雙乳桿菌產酶的影響。將L.plantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌L.acidophiluFCJX 104按1∶1混合復配，接種5%種子液于山楂-葛根汁中，在37 ℃下靜置培養。第16 h結束發酵并測定乙醛脫氫酶活性，研究不同山楂葛根比對發酵產乙醛脫氫酶的影響。

1.5.3.2 菌種比對雙乳桿菌產ALDH的影響

植物乳桿菌L.plantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌L.acidophiluFCJX 104按1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1混合復配，接種5%種子液于1∶1混合的山楂-葛根汁中，在37 ℃下靜置培養。在第16 h結束發酵并測定乙醛脫氫酶活性，研究菌種復配比例對發酵產乙醛脫氫酶的影響。

1.5.3.3 發酵時間對雙乳桿菌產ALDH的影響

植物乳桿菌L.plantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌L.acidophiluFCJX 104按1∶1混合復配，接種5%種子液于1∶1混合的山楂-葛根汁中，37 ℃下靜置培養。在第12、16、20、24、36 h取樣離心，測定乙醛脫氫酶活性。研究發酵時間對發酵產乙醛脫氫酶的影響。

1.5.3.4 正交試驗設計

在單因素實驗基礎上，選出山楂葛根比A(2∶1、1∶1、1∶2)、發酵時間B(14、16、18 h)、L.plantarumFCJX 102和L.acidophiluFCJX 104復配比例C(1∶2、1∶1、2∶1)，用SPSS軟件設計出3因素3水平正交試驗,對2株菌株發酵產乙醛脫氫酶條件進行優化(如表1所示)。

表1 SPSS正交設計分組Table 1 SPSS orthogonal design group

1.5.4 數據分析

每個指標重復測定 3 次，采用 SPSS 17.0 統計分析軟件進行顯著性分析，用Excel繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 乳酸桿菌生長曲線

按照1.5.1.1方法，得到副干酪乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的生長曲線。如圖1所示，鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌最早進入對數生長期，10 h進入穩定期；短乳桿菌和植物乳桿菌6 h進入對數期，這2種菌生長趨勢近似；副干酪乳桿菌生長最緩慢，8 h才進入對數生長期，18 h到穩定期。與FILHO[12]的研究中嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌均在24 h時進入對數期末期相比，L.plantarumFCJX 102和L.acidophiluFCJX 104具有更大的優勢。

圖1 乳酸桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacilli strains

2.2 產乙醛脫氫酶乳酸桿菌篩選

如圖2所示，能氧化乙醇生產乙酸的醋酸菌AcetobactercalcoaceticusFCJX 901所產乙醛脫氫酶活性最高，酵母菌SaccharomycescerevisiaeFCJX 502產酶活性次之，所產酶活分別為15.231 U/g和10.663 U/g，該結果與趙玉鳳[13]報道的醋酸桿菌A.calcoaceticusHB 1-1酶活性相當，證明本實驗所選測乙醛脫氫酶活性方法可行；5種乳桿菌中，只有植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌測到乙醛脫氫酶活性，所產酶活分別為13.931 U/g和7.625 U/g，但與酵母菌和醋酸菌的產乙醛脫氫酶能力仍有較大差距，但相比其他乳酸菌，可以產生一定量乙醛脫氫酶，可作為醒酒產品的發酵菌種。因此，將植物乳桿菌L.plantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌L.acidophiluFCJX 104作為后續實驗菌株。

圖2 各菌產ALDH活性(n=3)Fig.2 ALDH activity produced by Yeasts,Acetobacter,Lactobacillus (n=3)

2.3 雙乳桿菌發酵產酶的單因素實驗結果

2.3.1 山楂葛根比對產ALDH的影響

通過實驗發現，L.plantarumFCJX 102和L.acidophiluFCJX 104按照1∶1接種，山楂、葛根配比在1∶1時，發酵得到的乙醛脫氫酶酶活力最強為14.121 U/g；山楂和葛根是兩種常用于解酒護肝復方的原料，在LEE[14]研究中發現，葛根水提物對大鼠肝臟中乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性有促進作用。本試驗表明，葛根水提物亦可增強微生物的乙醛脫氫酶活性，僅用山楂水提物做培養基時，發酵的雙乳酸桿菌發酵液無乙醛脫氫酶活性，隨著葛根比例的增加，乙醛脫氫酶活性也隨之增強。

圖3 山楂葛根質量比對雙乳桿菌產ALDH的影響Fig.3 Effect of Hawthorn and Kudzu root ratio on ALDH production of dual Lactobacillus

2.3.2 菌種比例對產ALDH的影響

在2.2中我們獲知，L.plantarumFCJX 102 乙醛脫氫酶活性比L.acidophiluFCJX 104強，而由圖4顯示，菌種比例為1∶1時，乙醛脫氫酶活性最高。分別是相同接種量L.plantarumFCJX 102單獨發酵產酶活性的2.01倍、L.acidophiluFCJX 104單獨發酵產酶活性的3.93倍，結果表明2種乳酸菌共同發酵可促進產乙醛脫氫酶，復合發酵效果優于單一菌種發酵。

圖4 菌種復配比例對雙乳桿菌產ALDH的影響Fig.4 Effect of proportion of species complex on ALDH production of dual Lactobacillus

2.3.3 發酵時間對產ALDH的影響

通過圖5可以看出，12 h時，雙乳酸桿菌還未產乙醛脫氫酶；16 h時，菌體生長對數期結束，產酶活性最高；隨著發酵時間延長，發酵液中營養成分的含量隨之減少，此時乙醛脫氫酶作為一種氮源被消化吸收，用于乳酸菌的生長繁殖，所以乙醛脫氫酶活性隨著發酵時間的延長而降低。

圖5 發酵時間對雙乳桿菌產ALDH的影響Fig.5 Effect of fermentation time on ALDH production of dual Lactobacillus

2.4 正交試驗及數據分析

在單因素實驗基礎上，再利用正交設計對L.plantarumFCJX 102和L.acidophiuFCJX 104發酵產乙醛脫氫酶條件進行優化。選擇山楂和葛根比(2∶1、1∶1、1∶2)、發酵時間(14、16、18 h)、雙乳桿菌復配比例(1∶2、1∶1、2∶1)，用SPSS軟件設計出3因素3水平正交試驗，并照此設計進行試驗。

表2 主體間效應的檢驗(因變量：ALDH活性(U/g))Table 2 Inspection of intersubjective effects

注：a)R2=0 .985(調整R2= 0.941)。

在表2主體間效應檢驗中，校正模型一行是所用方差分析模型的檢驗，F=22.163，Sig=0.044< 0.05，表示該模型有統計學意義；因子A的Sig<0.05，山楂葛根比對發酵產乙醛脫氫酶有顯著影響；而因子B的Sig為0.255，表明發酵時間對產酶影響不顯著；因子C的Sig=0.078，說明菌種比對發酵產乙醛脫氫酶影響不顯著。

由SPSS 7.0 參數估計分析獲知，各表均值的最大數值即為最優發酵條件，也即是培養基中山楂葛根比為1∶2，L.plantarumFCJX 102、L.acidophiluFCJX 104菌種比例為2∶1時，在37 ℃下培養16 h，獲得乙醛脫氫酶活力最高。

表3 估算邊際均值(因變量:ALDH活性(U/g))Table 3 Estimate marginal means

2.5 正交優化模型驗證

按2.4正交優化得到的實驗條件，將雙乳酸桿菌接種于發酵培養基中，37 ℃下培養16 h，進行驗證試驗，測得其酶活力均值為16.083 U/g。同時，比較培養基在發酵前后變化。如圖6所示，發酵前，熬制的培養基為深褐色，嗅之有濃厚的山楂葛根風味。37 ℃發酵16 h后，發酵液顏色變為淺棕色，呈現略帶酸味的乳酸菌發酵芳香，測得其pH值為3.51±0.02。

圖6 山楂-葛根汁發酵前后變化Fig.6 The change of Hawthorn-Puerarin juice in the fermentation medium

3 結論

本文從短乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌中篩選出產乙醛脫氫酶的植物乳桿菌L.plantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌L.acidophiluFCJX 104。再由單因素實驗結果，選出山楂葛根比、發酵時間、L.plantarumFCJX 102和L.acidophiluFCJX 104復配比例，用SPSS軟件設計出3因素3水平正交試驗。由SPSS 17.0 參數估計分析獲知，各表均值的最大數值即為最優發酵條件，也即是培養基中山楂葛根比為1∶2，L.plantarumFCJX 102和L.acidophiluFCJX 104菌種比例為2:1時，在37℃下培養16 h，獲得乙醛脫氫酶活力最高，經驗證實驗證明正交優化可行，優化后最高酶活力可達到16.083 U/g。

研究報道山楂、葛根用于醒酒的主要成分分別是齊墩果酸、熊果酸和葛根素、大豆苷元。齊墩果酸、熊果酸可降低谷丙轉氨酶的濃度，減輕炎癥反應，促進肝細胞的再生，從而達到護肝的效果[15-16]；葛根素、大豆苷元可降低乙醇的吸收、提高ADH、ALDH的活性，促進乙醇在體內的代謝，從而達到醒酒的目的[14，17]。本文通過進行發酵產乙醛脫氫酶的乳酸菌-植物乳桿菌L.plantarumFCJX 102和嗜酸乳桿菌L.acidophiluFCJX 104對山楂、葛根提取汁，產生了較高酶活的乙醛脫氫酶，可將麻痹神經的乙醛轉化成無毒的乙酸，從而增強了它們醒酒護肝的效果。同時發酵過程產生的乳酸等成分賦予特殊的發酵食品風味，提高了山楂-葛根汁的風味。本研究結果對于開發解酒護肝防醉產品、保護飲酒人群的身體健康具有重要意義。

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StudyonaldehydedehydrogenasefromfermentationofHawthornPuerarinjuicebyLactobacillusplantarumFCJX102andLactobacillusacidophilusFCJX104

LUO Cheng1,2,WAN Yin1,2*,FU Gui-ming1,2,3,ZHANG Hong-ting1,2,3,GUO Shuai-ling1,2,3,TONG Huo-yan1,2,3,GUO De-bin4

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China) 2(College of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China) 3(Sino-German Food Engineering Center,Nanchang University,Nanchang 330047,China) 4(Jingxi Huangshanghuang Food Limitied Company,Nanchang 330052,China)

L.plantarumFCJX 102 andL.acidophiluFCJX 104 producing acetaldehyde dehydrogenase were selected from five kinds of lactic acid bacteria includingLactobacillusbrevis,Lactobacillusparacasei,Lactobacillusplantarum,LactobacillusacidophilusandLactobacillusrhamnosus.On the basis of single factor experiment,the fermentation conditions of Hawthorn Puerarin juice producing aldehyde dehydrogenase were studied by orthogonal optimization with hawthorn pueraria ratio,strain ratio and fermentation time as impact factors.Experimental results showed that when the ratio of hawthorn and puerarin in the medium was 1∶2 andL.plantarumFCJX 102 andL.acidophiluFCJX 104 was cultured at 37 for 16 with amount ratio of 2∶1,the highest enzyme activity of acetaldehyde dehydrogenase obtained after optimization was 16.083 U/g.

Hawthorn-Puerarin juice;Lactobacillusplantarum;Lactobacillusacidophilus; acetaldehyde dehydrogenase (ALDH)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015053

碩士研究生(萬茵副教授為通訊作者，E-mail：yinwan@ncu.edu.cn)。

2017-06-27，改回日期：2017-08-06