孫言,焦愛權(quán),李燕,徐學(xué)明,金征宇*
1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)
擠壓膨化對白湯醬油成曲糖化酶活力的影響
孫言1,2,焦愛權(quán)1,2,李燕1,2,徐學(xué)明1,金征宇1,2*
1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)
以面粉為原料進行擠壓膨化,以成曲糖化酶活力為評價指標(biāo),研究擠壓膨化參數(shù)對白湯醬油成曲糖化酶活力的影響。通過單因素試驗分別研究了面粉含水率、螺桿轉(zhuǎn)速、喂料速度和套筒溫度對糖化酶活力的影響。在單因素的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗,對擠壓膨化參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳的擠壓膨化參數(shù)為面粉含水率45%,螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min,喂料速度10 kg/h,套筒溫度80 ℃,在此條件下,糖化酶活力為1 293.49 U/g。利用高糖化酶活力的成曲,采用低鹽固態(tài)發(fā)酵方式進行白湯醬油釀造,測得白湯醬油的氨基酸態(tài)氮含量為0.65 g/dL,還原糖含量為243.25 mg/mL,醬油口味清甜,醬香濃郁。
擠壓膨化;白湯醬油;糖化酶;制曲
白湯醬油是江蘇蘇北地區(qū)特色的調(diào)味品,是一種以面粉為原料,蒸煮熟化后,經(jīng)微生物發(fā)酵生成的一種口味清甜,醇厚柔和,醬香、酯香味突出,澄清有光澤的淡色醬油[1]。
醬油釀造是制曲中微生物產(chǎn)生的多種酶與熟化的原料發(fā)生復(fù)雜生化反應(yīng)的結(jié)果,在這個反應(yīng)中,主要是蛋白質(zhì)和淀粉的水解[2-3]。該水解反應(yīng)的程度,將影響到原料利用率及產(chǎn)品的風(fēng)味與口感[4]。因此,制曲是醬油釀造中的重要一環(huán),提高成曲酶活力是提高醬油品質(zhì)的一條重要途徑[5]。而制曲的實質(zhì)是給曲霉提供最適生長環(huán)境,促使微生物分泌并積累大量的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等酶系。這些酶中,糖化酶可作為衡量白湯醬油成曲質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。這是因為糖化酶的糖化作用產(chǎn)生的單糖除了葡萄糖之外,還會生成一些果糖與五碳糖。這些對于醬油色澤的形成與發(fā)酵至關(guān)重要,若糖化作用完全,則白湯醬油甜味醇厚,體態(tài)濃厚,固形物含量高,可明顯提高醬油品質(zhì)[6-7]。
醬油釀造每一個工藝環(huán)節(jié)都是緊密相連,原料處理是為了在制曲過程中原料可被微生物更好的生長利用,以獲得更高的酶活力,進而使發(fā)酵高效的進行,因此原料處理效果與成曲酶活力關(guān)系密切。而利用擠壓膨化技術(shù)對原料處理時,擠壓膨化條件決定了原料處理效果,但擠壓膨化條件與成曲酶活力之間的關(guān)系卻少見研究報道。
本項目為提高白湯醬油成曲糖化酶活力,探討擠壓膨化條件與制曲酶活力之間的關(guān)系,從面粉含水率、螺桿轉(zhuǎn)速、喂料速度和套筒溫度4個參數(shù)出發(fā),以面粉為原料進行擠壓膨化,以糖化酶活力為指標(biāo),采用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗探討了不同擠壓膨化參數(shù)對糖化酶活力的影響,同時以高酶活力成曲進行低鹽固態(tài)發(fā)酵,為擠壓膨化技術(shù)應(yīng)用于醬油生產(chǎn)提供指導(dǎo)。
面粉:江蘇蘇美集團提供;醬油曲精:上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司;冰乙酸、乙酸鈉、Na2S2O3、Na2CO3、重鉻酸鉀、I2、KI、濃H2SO4、NaOH、可溶性淀粉(以上均為分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
FMHE36-24型雙螺桿擠壓機,湖南富馬科食品工程技術(shù)有限公司,螺桿直徑24 mm,長徑比24∶1;AL104型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RQH-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,鄭州生元儀器有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴,上海一恒科技有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DELTA320型pH計,上海分析儀器三廠;Eppendorf-5804R型冷凍離心機,德國艾本德有限公司。
1.3.1 操作要點
1.3.1.1 成曲制備
面粉經(jīng)過雙螺桿擠壓機處理后得到擠壓膨化物,待擠壓膨化物自然冷卻至室溫后,接入醬油曲精與面粉的混合物,曲精的用量為0.05%。然后均勻地平鋪在各個曲盤中,放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度控制在30~34 ℃,培養(yǎng)45 h之后結(jié)束制曲。
1.3.1.2 低鹽固態(tài)發(fā)酵
將成曲裝入1 000 mL的小型發(fā)酵罐內(nèi),控制醬醅水分約為55%,加入13°Bé 55-65 ℃的熱鹽水,待鹽水滲入成曲內(nèi)后將成曲壓實。發(fā)酵罐用封口膜封口,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),發(fā)酵30 d后過濾得到白湯醬油。
1.3.2 測定方法
1.3.2.1 粗酶液的提取
稱取5 g成曲(按干基重量計算),將成曲搗碎后用60 mL蒸餾水溶解,然后用糖化酶測定所需的乙酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 mL,放入40 ℃的水浴鍋內(nèi)浸提1 h,期間每隔10 min攪拌1次。浸提之后3 000 r/min離心15 min,取其上清液待測[8]。
1.3.2.2 糖化酶活力測定
參考國標(biāo)GB 8276—2006測定。
1.3.2.3 擠壓膨化物與傳統(tǒng)蒸煮物的微觀結(jié)構(gòu)分析
使用掃描電子顯微鏡(transmission electron microscope,SEM)對擠壓膨化物和傳統(tǒng)蒸煮物的微觀結(jié)構(gòu)進行直觀分析,樣品使用戊二醛進行固定,然后用磷酸緩沖液漂洗,之后用鋨酸固定并再次漂洗,干燥后用離子濺射法鍍膜,最后置于掃描電鏡內(nèi)觀察。
1.3.3 單因素試驗
選取4個因素進行單因素試驗,其中面粉含水率水平分別為25%、30%、35%、40%、45%,螺桿轉(zhuǎn)速分別為100、120、140、160、180 r/min,喂料速度分別為8、10、12、14、16 kg/h,套筒溫度分別為80、100、120、140、160 ℃。以糖化酶活力為指標(biāo),考察各因素對糖化酶活力的影響,確定其最佳因素水平。單因素試驗采用漸變式優(yōu)化法,研究第1個因素面粉含水率時,其他因素水平固定為:螺桿轉(zhuǎn)速140 r/min,喂料速度12 kg/h,套筒溫度120 ℃。
1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗
在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上確定4個因素的3個水平,以糖化酶活力為評價指標(biāo),根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理設(shè)計試驗優(yōu)化擠壓膨化參數(shù),因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken 中心組合設(shè)計的因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design
圖1是面粉經(jīng)過擠壓膨化和傳統(tǒng)蒸煮處理的掃描電鏡圖像,其中A圖是擠壓膨化處理后的圖像,B圖是傳統(tǒng)蒸煮處理后的圖像。兩種處理方式都使面粉里面的淀粉或其他組分發(fā)生了不同程度的破碎和降解。但蒸煮主要是熱作用,其大分子降解程度較低,從B圖中可明顯看到未被降解的淀粉顆粒,其結(jié)構(gòu)質(zhì)密,較為光滑。而擠壓膨化由于其高溫、高剪切力作用,大分子降解程度高,淀粉顆粒結(jié)構(gòu)被破壞程度大,且物料從模頭擠出時,水蒸氣急劇汽化,從而形成了A圖中結(jié)構(gòu)疏松,表面粗糙,不規(guī)則的微孔隙結(jié)構(gòu)。這樣就利于微生物的附著和對原料的充分利用。

圖1 面粉擠壓膨化與蒸煮處理的SEM圖像Fig.1 SEM images of wheat flour treated by extrusion and traditional steam cooking
2.2.1 面粉含水率對糖化酶活力的影響
由圖2可知,隨著面粉含水率的增加,糖化酶活力逐漸增大。當(dāng)面粉含水率在25%時,糖化酶活力為435.24 U/g,糖化酶活力處于較低水平。這主要是因為面粉含水率較低時,在經(jīng)過擠壓處理后,曲料里面的水分少,不利于營養(yǎng)物質(zhì)通過自由水?dāng)U散到基質(zhì)表面,微生物的生長受到抑制,從而限制了糖化酶活力的提高[9]。當(dāng)面粉含水率從25%增加到40%時,糖化酶活力增長速度明顯加快,而從40%增加到45%時,糖化酶活力增長速度趨于平緩。這主要是水分含量過高,曲料易結(jié)塊,擠壓膨化形成的多孔狀的結(jié)構(gòu)被破壞,空氣通透性變差,抑制了菌體的生長,影響菌體糖化酶的分泌,同時也易滋生腐敗菌,嚴(yán)重時會出現(xiàn)“酸曲”的現(xiàn)象,所以水分含量不宜從45%繼續(xù)升高。因此,面粉含水率可初步確定為45%。

圖2 面粉含水率對糖化酶活力的影響Fig.2 The effect of the moisture content of flour on glucoamylase activity
2.2.2 螺桿轉(zhuǎn)速對糖化酶活力的影響
由圖3可知,糖化酶活力都隨著螺桿轉(zhuǎn)速的提高而降低。糖化酶活力在螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min時最高,最高為952.23 U/g,之后隨著螺桿轉(zhuǎn)速提高而下降。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過140 r/min,酶活力下降的速度增快,轉(zhuǎn)速達到160 r/min后,酶活力不再變化。螺桿轉(zhuǎn)速提高,糖化酶活力降低,這主要是因為當(dāng)喂料速度一定時,螺桿轉(zhuǎn)速提高,物料在擠壓膨化機套筒內(nèi)停留的時間縮短,不利于淀粉分子的降解[10],同時蛋白質(zhì)在高水分、高轉(zhuǎn)速的情況下,變性程度降低[11],影響微生物對曲料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用。在擠壓機正常運行時,喂料速度與螺桿速度是相協(xié)調(diào)的,套筒內(nèi)既不過載也不可斷料,喂料速度固定后,若螺桿速度從100 r/min繼續(xù)降低就容易出現(xiàn)過載導(dǎo)致擠壓機堵塞。因此,螺桿轉(zhuǎn)速可初步確定為100 r/min。

圖3 螺桿轉(zhuǎn)速對糖化酶活力的影響Fig.3 The effect of screw speed on glucoamylase activity
2.2.3 喂料速度對糖化酶活力的影響
由圖4可知,糖化酶活力隨著喂料速度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,在喂料速度從8 kg/h增大至12 kg/h時,糖化酶活力變化幅度較小,10 kg/h時糖化酶活力最大為955.33 U/g。隨著喂料速度繼續(xù)增大至16 kg/h,糖化酶活力從952.23 U/g降低至689.95 U/g,降低了27.5%。在喂料速度超過某一范圍時,糖化酶活力明顯降低的主要原因是喂料速度和螺桿轉(zhuǎn)速共同決定了機筒填充程度[12],在螺桿轉(zhuǎn)速一定時,喂料速度增加,引起機筒填充度增加,擠壓機扭矩逐漸增大,機筒內(nèi)壓力增大,剪切作用力增強,對物料做功增加[13]。物料里面的淀粉過度糊化,蛋白質(zhì)過度變性,不利于菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用。因此,喂料速度可初步確定為10 kg/h。

圖4 喂料速度對糖化酶活力的影響Fig.4 The effect of feeding speed on glucoamylase activity
2.2.4 套筒溫度對糖化酶活力的影響
由圖5可知,糖化酶活力隨著套筒溫度的升高而呈降低的趨勢,在80 ℃時酶活力最高,糖化酶活力最高為1285.39 U/g,在160 ℃時,糖化酶活力達到最低,最低為579.90 U/g。套筒溫度升高,糖化酶活力降低,這主要是因為物料在低含水率,螺桿轉(zhuǎn)速小于140 r/min,膨化溫度80 ℃左右時,小麥面粉就會急劇糊化,當(dāng)水分含量提高時,小麥面粉的糊化度將進一步提高[10]。所以在面粉含水率為45%,套筒溫度80 ℃時,面粉已經(jīng)糊化,面粉中的蛋白質(zhì)適度變性,這樣有利于微生物對曲料的利用,菌體生長良好。而隨著套筒溫度進一步的提高,蛋白質(zhì)過度變性,水溶性降低,同時使原料焦糊,原料不易被菌體分泌的酶分解利用。過高的溫度也使水分在擠壓膨化處理過程中損失較多,造成曲料太干,微生物難以利用,從而造成糖化酶活力降低。若溫度降低至80 ℃以下,面粉中的淀粉不能達到適度的糊化度,沒法使菌體更好的利用。因此,套筒溫度可初步確定為80 ℃。

圖5 套筒溫度對糖化酶活力的影響Fig.5 The effect of barrel temperature on glucoamylase activity
在單因素試驗基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,選擇面粉含水率(A)、螺桿轉(zhuǎn)速(B)、喂料速度(C)和套筒溫度(D)進行4因素3水平響應(yīng)面分析試驗,共設(shè)計了29個試驗點,實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken central composite
2.3.1 擬合模型的建立及顯著性檢驗
采用Design-Expert.8.05b軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合,得到糖化酶活力對面粉含水率(A)、螺桿轉(zhuǎn)速(B)、喂料速度(C)和套筒溫度(D)的二次多項回歸方程:Y=1 277.052+21.305A-82.715 8B+90.324 17C+83.223 33D-54.462 5AC+56.957 5BD+61.03CD-112.97A2-94.138 5B2-110.996C2-142.237D2,進一步對回歸方程進行分析,其回歸系數(shù)顯著性分析結(jié)果見表3。
由表3可知,通過響應(yīng)面優(yōu)化后得到的模型F值為17.69,p<0.0001,表明回歸模型達到了極顯著水平,說明該模型可信。失擬項p=0.0996>0.05,表明失擬不顯著,模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=91.97%,說明該模型可以解釋91.97%響應(yīng)值的變化,因而該回歸方程擬合程度良好,用此模型可對糖化酶活力進行分析和預(yù)測。優(yōu)化的4個因素中B、C、D對糖化酶活力有極顯著的影響(p<0.01),交互項AC、CD、BD對糖化酶活力影響顯著(p<0.05),而二次項A2、B2、C2、D2影響水平達到極顯著(p<0.01)。通過F值大小可知,在試驗范圍內(nèi)各個因素對糖化酶活力影響的大小順序為喂料速度(C)>螺桿轉(zhuǎn)速(B)>套筒溫度(D)>面粉含水率(A)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance on regression model
注:“**”表示影響極顯著(p<0.01);“*”表示影響顯著(p<0.05)。
2.3.2 響應(yīng)面分析
從圖6~圖8可直觀地反映出各個因素相互作用對響應(yīng)值的影響,響應(yīng)面圖的三維曲面坡度,表明了響應(yīng)值的大小受到試驗因子的影響程度,坡度越陡峭,影響程度越大[14]。比較3組圖,喂料速度(C)對糖化酶活力影響最為顯著,其曲線比較陡峭,而螺桿轉(zhuǎn)速、套筒溫度、面粉含水率次之,其曲線比較平滑。從3組等高線圖可知,面粉含水率(A)和喂料速度(C)、螺桿轉(zhuǎn)速(B)和套筒溫度(D)、喂料速度(C)和套筒溫度(D)等高線圖呈現(xiàn)出明顯的橢圓形,表明兩因素間交互作用比較顯著。
2.2.3 驗證試驗
通過Design-Expert.8.05b軟件優(yōu)化得到,獲得最大糖化酶活力時的擠壓膨化參數(shù)為面粉含水率44.94%、螺桿轉(zhuǎn)速96.25 r/min、喂料速度10.47 kg/h、套筒溫度82.13 ℃,在此擠壓條件下糖化酶活力預(yù)測值為1319.25 U/g。為了方便驗證試驗,采用面粉含水率45%、螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min、喂料速度10 kg/h、套筒溫度80 ℃進行3次試驗,并以傳統(tǒng)蒸煮法處理面粉制曲后測成曲糖化酶活力作為對照。試驗結(jié)果如表4。試驗得到的糖化酶活力在1293.49 U/g左右,與預(yù)測值的誤差為1.95%,表明優(yōu)化結(jié)果可信。而采用傳統(tǒng)蒸煮處理面粉后制曲,成曲糖化酶活力為724.88 U/g,與對照相比,試驗組糖化酶活力提高了78.44%。

圖6 喂料速度與面粉含水率對糖化酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of feeding spend and the moisture content of flour on glucoamylase activity

圖7 套筒溫度與螺桿轉(zhuǎn)速對糖化酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of barrel temperature and screw speed on glucoamylase activity

圖8 套筒溫度與喂料速度對糖化酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of barrel temperature and feeding spend on glucoamylase activity
2.2.4 白湯醬油釀造試驗
以優(yōu)化后高糖化酶活力的成曲進行低鹽固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵30 d后過濾得到白湯醬油,測定其各項理化指標(biāo),結(jié)果見表5。白湯醬油口味清甜、色澤以鮮亮的淡紅色為主,帶有光澤,醬香濃郁,無不良氣味。

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 The result of verification test

表5 白湯醬油的理化指標(biāo)Table 5 Physiochemical indexes of white soy sauce
本實驗以提高糖化酶活力為目的,探討了擠壓膨化條件與制曲酶活力之間的關(guān)系。以面粉為原料進行擠壓膨化,通過單因素以及響應(yīng)面優(yōu)化試驗,得到最佳的擠壓膨化參數(shù)為面粉含水率45%,螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min,喂料速度10 kg/h,套筒溫度80 ℃,在此條件下,糖化酶活力為1 293.49 U/g。利用高糖化酶活力的成曲,采用低鹽固態(tài)發(fā)酵方式進行白湯醬油釀造,測得白湯醬油的氨基酸態(tài)氮含量為0.65 g/100 mL,還原糖含量為243.25 mg/mL醬香濃郁。本試驗也為擠壓膨化技術(shù)應(yīng)用在醬油釀造工業(yè)中提供一定的參考與指導(dǎo)。
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Effectofextrusionontheglucoamylaseactivityofkojiforwhitesoysauce
SUN Yan1,2,JIAO Ai-quan1,2,LI Yan1,2,XU Xue-ming1,JIN Zheng-yu1,2*
1(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)2(State key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)
Wheat flour was extruded to prepare koji of white soy sauce.The glucoamylase activity of koji is regarded as the index.The effects of different extrusion parameters on the glacoamylase activity of koji were studied.By single factor experiment,the effect of the moisture content of flour,screw speed,feeding speed and barrel temperature on the glucoamylase activity were investigated.Then the extrusion parameters were optimized by Response Surface Methodology (RSM).The results showed that the optimal glucoamylase activity was 1 293.49 U/g under the following extrusion conditions,including moisture content of 40%,screw speed of 100 r/min,feeding speed of 10 kg/h,and barrel temperature of 80 ℃.The koji with higher glucoamylase activity was utilized to ferment and the brewing experiment of white soy sauce was conducted by low-salt solid-state fermentation.At the end of fermentation,the contents of amino acid nitrogen and reducing sugar in the white soy sauce were 0.65 g/100mL and 243.25 mg/mL,respectively.The white soy sauce had sweet taste and good flavor.
extrusion;white soy sauce;glucoamylase;koji-making
10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014673
碩士研究生(金征宇教授為通訊作者,E-mail:jinlab2008@yahoo.com)。
國家科技支撐計劃項目子課題(2016YFD0400304)
2017-05-02,改回日期:2017-07-19