保留軟骨的去細胞全喉支架制備方法及在喉軟骨缺損中的修復效果

蘇莉莎 彭 濤 馮 俊 李紅光 李志勇 杜經緯 馬 鵬 吉 爽

(川北醫學院第二臨床醫學院 南充市中心醫院耳鼻咽喉科，四川 南充 637000)

保留軟骨的去細胞全喉支架制備方法及在喉軟骨缺損中的修復效果

蘇莉莎 彭 濤 馮 俊 李紅光 李志勇 杜經緯 馬 鵬 吉 爽

(川北醫學院第二臨床醫學院 南充市中心醫院耳鼻咽喉科，四川 南充 637000)

目的探討保留軟骨的去細胞全喉支架的制備方法及在大鼠喉軟骨缺損中的修復效果。方法取6只大鼠用于支架的制備，分離頸總動脈，結扎分支，經頸總動脈灌注去污劑(SDS、Triton X-100、PBS離子型)，3只大鼠去除喉黏膜、肌肉、韌帶的同時，保留細胞外基質和軟骨細胞制備保留軟骨的去細胞全喉支架，其余3只用于制備對照組支架。另取34只大鼠，建立0.5 cm×0.5 cm全層喉軟骨缺損模型，根據處理方法不同隨機分為對照組(n=17)和保留軟骨組(n=17)，對照組植入未經處理的異體喉骨支架，保留軟骨組植入保留軟骨的去細胞全喉支架，比較兩組的修復效果。結果①兩種支架經過脫細胞灌注處理后，全喉大體結構完整，體積未發生明顯的變化；②保留軟骨的去細胞全喉支架未見表面細胞組織填充，可見膠原、細胞外基質成分組成的腔隙，細胞之間結構緊密，存在于會厭、聲帶、環狀軟骨等表面；對照組支架組織中的細胞成分被完全去除，但是依稀可見網狀連接，結構之間不緊密；③免疫熒光結果顯示：保留軟骨的去細胞全喉支架除了有肌肉、軟骨細胞外，主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均為陰性；對照組支架免疫熒光染色下MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均為陽性；④保留軟骨組大鼠修復6 w后缺損部位存在少許不成熟的軟骨細胞，極少的軟骨形成陷窩，表面存在纖維組織及炎癥細胞；修復12 w后缺損部位得到修復，形成軟骨陷窩，炎癥反應減少；對照組修復6 w后缺損部位周圍軟骨細胞較少，缺損部位與周圍組織邊界明顯，存在大量炎癥細胞；修復12 w后存在少量纖維組織，存在炎癥因子。結論保留軟骨組植入保留軟骨的去細胞全喉支架在喉軟骨缺損中具有良好的修復效果。

去細胞全喉支架；喉軟骨缺損；免疫排斥反應；全層喉軟骨缺損模型

喉是人體中相對比較重要的器官，由軟骨、肌肉、黏膜、腺體等組成，先天性畸形、疾病或創傷等均容易引起喉軟骨缺損，發病后不僅會影響發音、吞咽及呼吸功能，還會影響患者美觀。由于喉所處位置特殊，當喉缺損后再生能力相對較低，患者在移植術后需要長期服用免疫抑制劑，增加了感染率腫瘤患者增加復發及轉移率，難以達到預期的治療效果〔1〕。有報道〔2〕顯示，通過去細胞方法能構建出具備天然三維結構的支架，且支架中復合種子細胞能制備出具備移動功能的組織或器官。由于喉的支架具備合成和分泌軟骨基質、膠原纖維的能力，再加上軟骨細胞被軟骨基質嚴密包裹，能避免軟骨細胞與外界的抗原物質相互接觸〔3〕。報道顯示〔4〕，保留軟骨的去細胞全喉支架能維持原有軟骨細胞的活性，將其運用于喉軟骨缺損中效果理想，能促進缺損部位早期愈合，提高修復效果，但是該結論尚未得到進一步證實。此外，直接的同種異體移植需要長期使用免疫抑制劑，避免免疫排斥反應。通過對人喉主要組織相容性抗原研究發現〔5〕：人喉主要組織相容性抗原位于黏膜上皮層、黏膜下腺、軟骨膜，而在軟骨基質中并不表達。因此，保留軟骨植入同種異體中并不會引起免疫排斥反應。本課題旨在探討保留軟骨的去細胞全喉支架的制備方法及在大鼠喉軟骨缺損中的修復效果。

1 對象與方法

1.1對象 取2014年10月至2016年4月進行實驗的SD大鼠40只作為研究對象，雌雄隨機，4月齡，體重190～230 g，平均(214±12)g，所選動物均由醫院動物實驗中心提供。實驗過程中對SD大鼠飼養、處理均符合《關于善待實驗動物的指導下意見》〔6〕相關規則，許可證號SCKK2015-0023，均給予精制顆粒飼料，自由飲水。實驗均通過醫院動物委員會批準同意。40只大鼠，6只大鼠用于支架的制備，34只大鼠建立全層喉軟骨缺損模型，根據處理方法不同隨機分為對照組和保留軟骨組，每組17只。

1.2主要儀器和試劑 見表1。所用的儀器和試劑均由相應公司提供。

表1 主要儀器和試劑

1.3方法 去細胞全喉支架制備：取6只大鼠用于支架的制備，將大鼠放置在CW-CJ-ZFD超凈工作臺上，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉，大鼠仰臥、固定在手術臺上，脫毛劑備皮，待麻醉生效后消毒、鋪巾〔7〕。從大鼠頸前正中部位做長3 cm切口，逐層分離皮下組織、頸前肌群，充分暴露氣管、喉、兩側頸總動脈，分離頸總動脈上的甲狀腺下動脈，結扎分支。在雙側甲狀腺下動脈分叉下端1.5 cm部位放置0.45 mm的頭皮針，利用絲線固定頭皮針。通過頭皮針向血管中注入少許肝素、生理鹽水，檢測血管的完整性，切斷頸總動脈結扎部位的血管，游離喉、頸外動脈，去除喉黏膜、肌肉、韌帶的同時保留細胞外基質和軟骨細胞制備保留軟骨，其余3只用于制備對照組支架(對照組支架不經過任何處理)；保留軟骨的去細胞全喉支架經頸總動脈利用把控麻醉泵向甲狀腺動脈、甲狀腺下動脈采用含有腺苷、肝素鈉的PBS進行15 min灌注，采用1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的去離子水持續24 h灌注，采用去污劑(SDS、Triton X-100、PBS離子型)，灌注速度為20 ml/h，連續灌注15 min，在灌注的同時，在喉組織上方放置一輸液瓶，滴加RPMI1640培養液，為喉支架提供營養，避免喉體干燥，制備保留軟骨的去細胞全喉支架〔8〕。

全層喉軟骨缺損模型建立及處理方法：另取34只大鼠，耳緣靜脈注射4%異戊巴比妥(60 mg/kg)進行全身麻醉，將大鼠固定在手術臺上，對頸部進行剃毛、常規消毒后鋪巾，從頸前正中作5 cm切口，分離皮下、基層，充分暴露甲狀軟骨，并且在左側利用0.5 mm×0.5 mm鉆頭(鉆頭3 cm部位刻有標記)作0.5 mm×0.5 mm全層軟骨缺損，建立大鼠全層喉軟骨缺損模型，深度以鉆頭標記部位為準，避免穿透喉黏膜，見圖1〔9〕。

大鼠喉軟骨缺損模型建立完畢后進行止血處理，采用生理鹽水對建模部位進行清洗。取制備好的保留軟骨的去細胞全喉支架與對照組支架，將其修剪為0.5 mm×0.5 mm大小，對照組采用未經處理的支架進行修復，保留軟骨組植入保留軟骨的去細胞全喉支架修復，連續進行12 w修復。兩組大鼠修復后對創面進行縫合，采用由紗、無菌紗布組成的雙層敷料對創面進行覆蓋、包扎，并根據每一位大兔情況做好預防性感染措施，送回籠中飼養〔10〕。標本的收集及保存：兩組大鼠修復6、12 w時采用脊椎脫臼法每組分別處死7只和10只SD大鼠，取缺損部位修復組織，并將雙側關節放入濃度為4%的多聚甲醛溶液中保存、待用〔11〕。

圖1 全層喉軟骨缺損模型建立

1.4觀察指標 (1)支架大體觀察。觀察保留軟骨的去細胞全喉支架與對照組支架大體情況。(2)支架掃描電鏡觀察。取兩組制備的支架，簡單修剪后，采用離子濺射儀進行噴金鍍膜，掃描電鏡觀察兩種材料的形態、結構〔12〕。(3)免疫學檢測。將兩組支架放入4%多聚甲醛中固定，利用蔗糖梯度脫水后，冰凍切片機進行切片，PBS 3 min清洗，連續沖洗3次，將切片放入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，煮沸，自然冷卻30 min，PBS沖洗3次，加入大鼠主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ RT1a、抗大鼠MHCⅡ H-2L一抗，加入等量PBS溶液作為陰性對照組，加入二抗，PBS沖洗后進行二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)3 min染色，熒光顯微鏡下觀察〔13〕。(4)HE染色。兩組大鼠修復6、12 w后取大鼠喉部及周圍組織，將其放入甲醛中固定，無水乙醇梯度脫水，制備4 μm切片，行HE染色，光鏡下觀察缺損部位形態〔14〕。

1.5統計學方法 應用SPSS18.0軟件，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結 果

2.1實驗動物數量分析 參加實驗的40只SD大鼠全部進行結果分析，中途無脫落。

2.2支架大體觀察比較 兩種支架經過脫細胞灌注處理后，全喉大體結構完整，喉組織顏色為蒼白色、透明，體積未發生明顯的變化，硬度無明顯的改變，喉的三維結構無明顯變化。見圖2。

2.3兩組支架掃描電鏡觀察 保留軟骨的去細胞全喉支架未見表面細胞組織填充，可見膠原、細胞外基質成分組成的腔隙，細胞之間結構緊密，存在于會厭、聲帶、環狀軟骨等表面；對照組支架組織中的細胞成分被完全去除，但是依稀可見網狀連接，結構之間不緊密。見圖3。

2.4兩組支架免疫學水平比較 免疫熒光結果顯示：保留軟骨的去細胞全喉支架除了有肌肉、軟骨細胞外，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均為陰性；對照組支架免疫熒光染色下MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均為陽性。見圖4。

圖2 支架大體觀察比較

圖3 兩組支架掃描電鏡觀察(×100)

A：保留軟骨組；B：對照組；C：軟骨組織，P：骨膜，DM：細胞基質，M：肌肉，下圖同圖4 兩組支架免疫學水平比較(×100)

2.5兩組大鼠修復后大體觀察 兩組大鼠修復后均呼吸通暢、正常，未出血喘鳴等，進食和活動情況良好，術后傷口均一期愈合，未見化膿或感染現象。保留軟骨組大鼠均未見排斥反應，對照組大鼠修復后需要服用免疫抑制劑。

2.6兩組大鼠修復后6 w、12 w HE染色情況比較 保留軟骨組大鼠修復6 w后缺損部位存在少許不成熟的軟骨細胞，極少的軟骨形成陷窩，表面存在纖維組織及炎癥細胞；修復12 w后缺損部位得到修復，形成軟骨陷窩，炎癥反應減少；對照組修復6 w后缺損部位周圍軟骨細胞較少，缺損部位與周圍組織邊界明顯，存在大量炎癥細胞；修復12 w后存在少量纖維組織，存在炎癥因子，見圖5。

A、C圖分別為保留軟骨組大鼠修復6 w、12 w HE染色情況；B、D圖分別為對照組大鼠修復6 w、12 w HE染色情況圖5 兩組大鼠修復6 w、12 w HE染色情況比較(×100)

3 討 論

軟骨缺損是臨床上常見的疾病，該部位位置相對特殊，缺乏血管及再生能力，當軟骨部位發生缺損后自我修復能力相對較差，難以滿足修復要求。隨著醫療技術的不斷發展，軟骨組織缺損修復經歷了傳統自體修復到異體骨修復及人工材料修復過程，為軟骨缺損的修復提供方法〔15〕。軟骨組織工程技術是一門新型的學科，通過制備干細胞并接種在支架上植入缺損部位后能形成新的組織，實現軟骨部位的修復〔16〕。

由于喉部位缺乏豐富的血運、神經，自體移植受到來源及大小的限制難以滿足修復需要，異體骨移植后由于含有免疫細胞及免疫組織，導致喉移植后難以解決免疫排斥問題。目前，喉支架復合物MHC常表達于供體的淋巴細胞及樹突細胞中，屬于最常見的致敏原，且免疫排斥反應與供體、受體中MHC抗原的匹配程度關系密切。本課題利用灌注去離子劑法制備去細胞全喉支架，制備過程中去除了介導免疫排斥反應的主要組織〔17〕。兩種支架全喉大體結構完整，蒼白色、透明，體積未發生明顯的變化，硬度無明顯的改變，提示利用脫細胞灌注處理后能制備理想的支架。保留軟骨組織是一種特殊的組織〔18〕，能合成和維持軟骨基質的結構，能維持三維支架結構。此外，軟骨部位在支架中被軟骨基質包裹，不會與外界接觸，能降低免疫排斥反應。本研究中，免疫熒光結果顯示，保留軟骨的去細胞全喉支架具有良好的生物相容性，植入機體后不會引起免疫排斥反應，被稱為“免疫豁免性”，即在同種異體移植中不會產生免疫排斥反應〔19〕。去細胞全喉支架經過去細胞處理后，主要成分為細胞外基質、軟骨細胞，而細胞外基質主要是由蛋白和活性分子構成，能構成一種動態平衡〔20〕。為了進一步驗證去細胞全喉支架的修復效果，本課題中建立了大鼠喉軟骨缺損模型，分別植入喉軟骨缺損去細胞全喉支架與未經處理的支架，結果表明兩組大鼠修復后均呼吸通暢，進食和活動情況良好，術后傷口均一期愈合，未見化膿或感染現象。保留軟骨組大鼠均未見排斥反應，對照組大鼠修復后需要服用免疫抑制劑，可見兩種支架均能促進喉軟骨部位修復，但是對照組需要長期服用免疫抑制劑抑制排斥反應，不利于缺損部位修復〔21〕。組織學分析提示去細胞全喉支架能促進缺損部位修復，有效抑制炎癥反應，提高缺損部位修復。而未經處理的支架植入異體缺損部位后容易發生免疫排斥反應，增加機體炎癥發生，不利于組織、器官的再生〔22〕。

綜上所述，利用環甲動脈持續灌注去污劑在去除喉黏膜、肌肉、韌帶的同時，保留細胞外基質和軟骨細胞能成功制備SD大鼠去細胞全喉支架，運用于大鼠喉軟骨缺損中能促進缺損部位愈合，具有廣泛的運用前景。

1聶鵬飛，陳少文，應小洲，等.誘導膜技術治療大段骨缺損的研究進展〔J〕.中華創傷骨科雜志，2013;15(5)：439-40.

2Bus MP，Bramer JA，Schaap GR，etal.Hemicortical resection and inlay allograft reconstruction for primary bone tumors：a retrospective evaluation in the Netherlands and review of the literature〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2015;97(9)：738-50.

3Pan Z，Duan P，Liu X，etal.Effect of porosities of bilayered porous scaffolds on spontaneous osteochondral repair in cartilage tissue engineering〔J〕.Regen Biomater,2015;2(1)：9-19.

4劉永剛，周香桃.聚乳酸-乙醇酸共聚物/羥基磷灰石復合支架修復喉軟骨缺損〔J〕.中國組織工程研究，2015;19(52)：8379-83.

5Musumeci G，Loreto C，Castorina S，etal.New perspectives in the treatment of cartilage damage.Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) scaffold〔J〕.Ital J Anat Embryol,2013;118(2)：204-10.

6杜 兵，陳巨峰，符志峰.計算機輔助設計與制作在磁性固位分體式上頜骨贗復體修復中的應用〔J〕.中華口腔醫學研究雜志：電子版，2011;5(2)：178-83.

7李 亮，張鑫鑫，姜曉銳，等.雪旺細胞促進組織工程骨修復大鼠股骨損的實驗研究〔J〕.中華創傷骨科雜志，2013;15(2)：148-52.

8邱耿韜.磷酸鈣骨水泥在骨組織再生修復應用中的研究進展〔J〕.中國矯形外科雜志，2013;21(14)：1406-8.

9胡金龍.組織工程學技術治療骨缺損的最新研究進展〔J〕.中國矯形外科雜志，2013;21(2)：150-3.

10李廣恒，金 丹，鄭 波，等.骨骼肌來源的細胞在骨和軟骨組織修復與再生中的應用〔J〕.中華創傷骨科雜志，2013;15(3)：266-8.

11Tan HL，Tan DY，Zhao JK.Treatment of thumb soft-tissue defects using a bipedicle island flap of the index finger：anatomical basis and clinical application〔J〕.Arch Orthop Trauma Surg,2013;133(5)：721-8.

12吳延平，吳 方.聚羥基烷酸酯聚合物負載軟骨細胞修復同種異體喉軟骨缺損〔J〕.中國組織工程研究，2015;19(38)：6140-4.

13魏 波，金成哲，徐 燕，等.BMSCs來源細胞外基質支架對微骨折骨髓刺激術后血凝塊體外軟骨化分化的作用研究〔J〕.中國修復重建外科雜志,2013;27(4)：464-74.

14劉藝昌，周 敬.同種異體和異種來源骨髓間充質干細胞誘導成軟骨修復喉軟骨缺損〔J〕.中國組織工程研究，2016;20(7)：966-71.

15蔡 峰，韋繼南，謝鑫薈，等.基質細胞衍生因子-1/趨化因子受體4信號軸調控骨髓間充質干細胞在退變椎間盤中遷移〔J〕.中華實驗外科雜志，2015;32(4)：843-6.

16管大凡，劉洪美，張 聰，等.骨形態發生蛋白2/血管內皮生長因子165轉染骨髓間充質干細胞復合多孔納米羥基磷灰石/聚酰胺66修復兔橈骨缺損〔J〕.中華創傷雜志，2015;31(4)：353-9.

17藺文魁，馬 敬.骨髓間充質干細胞分離擴增與誘導分化的研究進展〔J〕.臨床軍醫雜志，2014;42(3)：291-5.

18Zhu S，Zhang B，Man C，etal.Combined effects of connective tissue growth factor-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells and NaOH-treated PLGA scaffolds on the repair of articular cartilage defect in rabbits〔J〕.Cell Transplant,2014;23(6)：715-27.

19Fu WL，Zhou CY，Yu JK.A new source of mesenchymal stem cells for articular cartilage repair：MSCs derived from mobilized peripheral blood share similar biological characteristics in vitro and chondrogenesis in vivo as MSCs from bone marrow in a rabbit model〔J〕.Am J Sports Med,2014;42(3)：592-601.

20Qi BW，Yu AX，Zhu SB，etal.Chitosan/poly(vinyl alcohol) hydrogel combined with Ad-hTGF-β1 transfected mesenchymal stem cells to repair rabbit articular cartilage defects〔J〕.Exp Biol Med(Maywood),2013;238(1)：23-30.

21趙可慶，翟立杰，王志強，等.基因芯片篩選骨髓間充質干細胞與透明軟骨細胞的差異表達基因〔J〕.大連醫科大學學報，2008;30(5)：405-9.

22崔 翔，侯瑞霞，李 群，等.殼聚糖在喉軟骨組織工程中的應用〔J〕.組織工程與重建外科雜志，2015;11(3)：208-12.

R76

A

1005-9202(2017)24-6013-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.004

四川省衛生廳資助項目(No.140112)

蘇莉莎(1980-)，女，碩士，主治醫師，主要從事耳鼻咽喉科臨床研究。

〔2017-04-10修回〕

(編輯 袁左鳴)