過氧化物酶體增殖物PGC-1α對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

畢華強(qiáng)，李曉武,劉 輝，張 曦

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科，重慶 400038)

·論著·

過氧化物酶體增殖物PGC-1α對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

畢華強(qiáng)，李曉武,劉 輝，張 曦△

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科，重慶 400038)

目的探討過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法構(gòu)建大鼠肝缺血再灌注損傷模型，恢復(fù)灌注后12 h，以蛋白免疫印跡(Western blot)檢測PGC-1α表達(dá)情況，并檢測肝臟活性氧、三磷酸腺苷(ATP)水平及血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性變化，評(píng)估肝功能情況。另一方面，構(gòu)建PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體，并在大鼠缺血再灌注前轉(zhuǎn)染，于缺血再灌注后，再以Western blot檢測PGC-1α表達(dá)，肝臟活性氧、ATP水平和血肝酶活性變化，評(píng)估PGC-1α表達(dá)對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。結(jié)果缺血再灌注肝臟PGC-1α表達(dá)較假手術(shù)組及對(duì)照組(未手術(shù))明顯降低(均P<0.05)，同時(shí)肝臟活性氧族水平及ALT活性顯著升高，而肝ATP產(chǎn)生減少(均P<0.05)。PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)缺血再灌注肝臟PGC-1α表達(dá)，同時(shí)肝臟活性氧族水平及ALT活性較未轉(zhuǎn)染組顯著降低，而肝ATP產(chǎn)生增加(均P<0.05)。結(jié)論P(yáng)GC-1α表達(dá)有利于保護(hù)肝缺血再灌注損傷。

過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-1α；肝；再灌注損傷

肝缺血再灌注損傷是肝移植及肝切除術(shù)后急性肝功能損傷的主要原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)肝缺血再灌注后，肝臟線粒體融合蛋白2(Mfn2)表達(dá)顯著降低，且與肝功能損害程度相關(guān)。進(jìn)一步研究表明Mfn2作為下游靶蛋白，受過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α)調(diào)節(jié)，同時(shí)過氧化物酶體增殖物受體γ激動(dòng)劑羅格列酮也可減輕肝缺血再灌注損傷[3]，提示PGC-1α可能對(duì)肝缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。本研究建立大鼠肝缺血再灌注模型，觀察PGC-1α的表達(dá)變化與肝功能損傷間的關(guān)系，并構(gòu)建PGC-1α的清蛋白啟動(dòng)子慢病毒過表達(dá)載體，使PGC-1α在肝臟特異性過表達(dá)，觀察PGC-1α過表達(dá)后，對(duì)缺血再灌注肝功能的影響，探討PGC-1α對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與材料 體質(zhì)量250～300 g雄性SD大鼠購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。慢病毒包裝顆粒購自上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司，PGC-1α一抗及血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性檢測試劑盒購自美國Abcam公司。β-actin一抗和二抗購自美國Santa Cruz生物公司。活性氧檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增鼠清蛋白啟動(dòng)子(-449 ～ +100,GenBank accession no.NM_009654)，并克隆至pMD19-T載體，然后將此載體插入慢病毒顆粒的PacⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)間，以替代原慢病毒GC啟動(dòng)子，再將大鼠PGC-1α基因(GenBank accession no.NM_031347.1) 克隆至上述慢病毒載體中，使其位于清蛋白啟動(dòng)子下游。將此慢病毒顆粒包裝入質(zhì)粒 pHelper 1.0，應(yīng)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)功能性病毒滴度后，以親和色譜濃縮、純化上述慢病毒顆粒。

1.2.2大鼠慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染及肝缺血再灌注模型建立 將2×107TU 的PGC-1α慢病毒或空載體慢病毒重懸入1 mL Opti-MEM Ⅰ培養(yǎng)基，并經(jīng)尾靜脈注射。2周后，麻醉大鼠，開腹，以無損傷血管夾阻斷供應(yīng)肝中葉及肝左葉的肝動(dòng)脈和門靜脈血流90 min，然后開放血管夾恢復(fù)血供，建立肝缺血再灌注損傷模型(模型組)[4]。以不阻斷肝血供的假手術(shù)模型(假手術(shù)組)作為對(duì)照。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot) 肝血供恢復(fù)后12 h處死大鼠，取1 g肝組織勻漿后，加入蛋白裂解液提取總蛋白。煮沸變性后按30 μg /孔上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以5%脫脂奶粉封閉60 min，加入PGC-1α一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后，ECL發(fā)光，曝光顯影。

1.2.4肝活性氧檢測 將1 g肝組織勻漿后應(yīng)用清潔液漂洗，再以300 r/min離心5 min。將組織沉淀依據(jù)試劑盒說明書處理后，用熒光分光光度計(jì)檢測活性氧水平。

1.2.5肝ATP檢測 將20 mg肝組織用組織裂解液裂解后，以12 000 r/min離心10 min，收集上清液。上清液依據(jù)試劑盒說明書處理后，用熒光分光光度計(jì)檢測ATP水平。

1.2.6ALT活性檢測 大鼠處死后，收集血液，以3 000 r/min離心10 min獲取血清，血清依據(jù)試劑盒說明書處理后，用酶標(biāo)儀檢測ALT活性。

2 結(jié) 果

2.1肝PGC-1α表達(dá)與缺血再灌注損傷 Western blot檢測顯示，肝臟缺血再灌注12 h后，模型組PGC-1α表達(dá)水平較正常肝臟(未手術(shù)組)及假手術(shù)組肝臟明顯降低(圖1)。同時(shí)模型組肝臟活性氧水平較假手術(shù)組及未手術(shù)組顯著升高，而ATP產(chǎn)生明顯減少，ALT活性也顯著上升(均P<0.05)，見圖2。

A:Western blot;B:定量分析圖；a：P<0.05，與模型組比較

圖1各組大鼠肝臟PGC-1α的表達(dá)比較

A：肝活性氧；B：肝ATP；C：ALT；a：P<0.05，與模型組比較。

圖2各組大鼠肝功能性損傷檢測結(jié)果比較

2.2PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染保護(hù)缺血再灌注肝PGC-1α表達(dá) 于術(shù)前2周，經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染含清蛋白啟動(dòng)子的PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體，2周后行缺血再灌注手術(shù)，恢復(fù)再灌注12 h后，轉(zhuǎn)染組缺血再灌注肝臟PGC-1α表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載體組顯著升高，見圖3。

2.3保護(hù)肝PGC-1α表達(dá)減輕缺血再灌注損傷 經(jīng)轉(zhuǎn)染含清蛋白啟動(dòng)子的 PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體，保護(hù)肝臟PGC-1α表達(dá)后，缺血再灌注肝活性氧水平較未轉(zhuǎn)染組及空載體組顯著降低，而ATP產(chǎn)生明顯增加，ALT活性也顯著下降(均P<0.05)，見圖4。

A:Western blot;B:定量分析圖；a：P<0.05，與轉(zhuǎn)染組比較。

圖3各組大鼠肝PGC-1α水平比較

A：肝活性氧；B：肝ATP；C.ACT；a：P<0.05，與轉(zhuǎn)染組比較。

圖4肝PGC-1α表達(dá)對(duì)肝缺血再灌注損傷的影響

3 討 論

肝缺血再灌注損傷造成的肝功能異常顯著增加肝移植術(shù)患者、肝切除術(shù)患者及肝創(chuàng)傷患者的病死率[1-2,5]。防止缺血再灌注損傷是防止肝臟術(shù)后肝功能異常，改善患者生存率的重要策略。肝細(xì)胞線粒體形態(tài)、功能損傷是肝缺血再灌注損傷的主要超微病理特征[6-7]。近來研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α是熱源性的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)和呼吸功能而參與細(xì)胞能量代謝，PGC-1α的表達(dá)缺失將導(dǎo)致生理刺激產(chǎn)生的ATP減少[8-9]。因此探討PGC-1α在缺血再灌注損傷中的作用，對(duì)于開發(fā)防治缺血再灌注損傷策略具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝缺血再灌注后，肝臟PGC-1α表達(dá)明顯降低，而肝臟活性氧水平顯著升高，ATP產(chǎn)生減少，提示PGC-1α表達(dá)與缺血再灌注后肝細(xì)胞線粒體功能障礙顯著相關(guān)。有研究表明，肝缺血再灌注后，PGC-1α低表達(dá)可造成肝細(xì)胞活性氧水平顯著增加，而活性氧對(duì)線粒體的能量代謝呼吸鏈具有顯著損傷、破壞及毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體腫脹，ATP能量產(chǎn)生障礙，最終使得肝細(xì)胞死亡[3]。肝細(xì)胞死亡使得肝酶釋放入血，進(jìn)而造成ALT等活性增加，提示肝功能損害。因此，PGC-1α的表達(dá)與肝細(xì)胞線粒體損傷和肝功能損害呈負(fù)相關(guān)。而轉(zhuǎn)染含清蛋白啟動(dòng)子的 PGC-1α慢病毒過表達(dá)載體，可使 PGC-1α在清蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下在缺血再灌注后的肝臟特異性表達(dá)。當(dāng)PGC-1α表達(dá)逆轉(zhuǎn)后，肝臟ATP的產(chǎn)生明顯增加，活性氧水平顯著下降，ACT活性降低，提示PGC-1α的表達(dá)對(duì)于肝缺血再灌注損傷具有顯著保護(hù)作用。

本研究提示PGC-1α可能是肝缺血再灌注損傷的重要調(diào)節(jié)因子。羅格列酮作為過氧化物酶體增殖物受體γ激動(dòng)劑，可促進(jìn)PGC-1α表達(dá)而減輕肝缺血再灌注損傷。因此，研發(fā)新的PGC-1α表達(dá)誘導(dǎo)劑，有助于更有效防治缺血再灌注損傷。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α對(duì)線粒體形態(tài)功能的保護(hù)調(diào)節(jié)作用，依賴于下游線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)，PGC-1α通過調(diào)節(jié)Mfn2表達(dá)減輕線粒體形態(tài)功能損傷[3]，因此，研發(fā)PGC-1α/Mfn2通路激活劑，可能是防治肝缺血再灌注損傷的又一新策略。

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Protectiveeffectofperoxisomeproliferatorreceptorγcoactivator-1αonhepaticischemia-reperfusioninjury

BiHuaqiang,LiXiaowu,LiuHui,ZhangXi△

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,SouthwestHospital,theArmyMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of peroxisome proliferator receptor γ coactivator (PGC) -1α on hepatic ischemia-reperfusion injury.MethodsThe rat model of hepatic ischemia-reperfusion injury was established.The expression of PGC-1α was detected by Western blot after 12 hours of reperfusion.The changes of reactive oxygen species(ROS),ATP level and serum liver enzyme activity were measured,and the liver function was evaluated.On the other hand,PGC-1α lentiviral overexpression vector was constructed and transfected in rat before ischemia-reperfusion.After ischemia-reperfusion,the expression of PGC-1α,liver ROS,ATP level were measured by Western blot to explore the protective role of PGC-1α in liver ischemia reperfusion injury.ResultsThe expression of PGC-1α in ischemia-reperfusion liver was significantly lower than that in the control group (P<0.05).The level of ROS[(325.4±70.9)RLUvs.(108.5±25.2)RLU,P<0.05],the ALT activity in serum[(367.8±82.7)U/Lvs.(98.7±16.8 )U/L,P<0.05]in ischemia-reperfusion liver were increased than that in the control group,whereas liver ATP production was reduced[(6.1±3.7)pmolvs.(19.8±3.1)pmol,P<0.05)].The expression of PGC-1α in the liver was significantly up-regulated by PGC-1α lentiviral overexpression vector (57.3 ± 21.3) U/Lvs. (311.2±25.8) U/L,P<0.05),down-regulated ROS[(98.7±18.9)RLUvs.(300.2±45.6)RLU,P<0.05] and serum glutamic-pyruvic transaminase[(105.3±21.3)U/Lvs.(311.2±25.8)U/L,P<0.05)],and increased liver ATP production [(17.3±3.1)pmolvs.(5.8±2.0)pmol,P<0.05]in contrast to non-transfected rats.ConclusionPGC-1α contributes to protect liver ischemia reperfusion injury.

] peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α;liver;reperfusion injury

畢華強(qiáng)(1979-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事肝膽、胰腺的外科治療與腫瘤治療?！?/p>

，E-mail:13079242@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.002

R657.3

A

1671-8348(2017)36-5044-03

2017-08-18

2017-09-26)