基于復雜網絡的穴位-分子生物學效應研究＊

黃滿婷，雷 蕾，李海燕，楊 策，聶 瑩，亢 力

（中國中醫科學院中醫藥信息研究所 北京 100700）

復雜網絡作為一種新興的科學研究方法和工具，為復雜系統的研究打開了新的視角，其研究涉及到系統科學、數學、統計物理學、計算機科學等多個學科[1]。近年來，中醫藥領域復雜性研究對復雜網絡的應用逐漸增多，大量研究表明，采用復雜網絡方法和工具可以更加深入且直觀地體現出中醫藥復雜體系中的科學性[2]。針刺穴位的作用機制一直以來是研究者們關注的熱點問題，亦因此產生了大量的研究成果，前期本研究團隊以疾病腦缺血為出發點，以文獻研究成果為數據來源，運用復雜網絡的方法探討了針刺治療腦缺血的選穴規律及其分子作用機制[3]，為本次研究奠定了一定的基礎。本研究旨在探尋更多的穴位-分子效應關系，以期為相關領域研究者及臨床應用提供一些參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源

采用檢索策略：針刺OR針灸OR電針（特征詞：動物），文獻年限為1956-2015年12月，從《中國知網》（CNKI）、《萬方數據資源庫》和《中國生物醫學文獻數據庫》（CBM）三大數據庫中檢索針刺實驗文獻題錄，以“基因表達”和“蛋白表達”為關鍵詞和主題詞對文獻題錄進行篩選，去重后獲得研究所需文獻。

1.2 文獻納入標準和排除標準

納入標準：針刺療法的動物實驗研究文獻

排除標準：①文獻綜述；②人或動物的臨床實驗文獻；③以針刺作為對照組的文獻；④藥物注射對針刺效應影響的相關文獻；⑤火針、刺血療法、電刺激療法及砭法相關文獻；⑥單純穴位療法及單純艾灸療法相關文獻；⑦按摩推拿療法、運動針療法及心理療法相關文獻；⑧針藥結合相關文獻。

1.3 數據規范

根據原文采集針刺部位信息和其相對應的有效調節的分子水平效應信息，針刺部位數據參照中醫藥主題詞表（TCMeSH 2015）版＊＊ 中國中醫科學院中醫藥信息研究所.中國中醫藥主題詞表:[DB/OL].(2015-11-27)[2017-04-25].http://tcmks.cintcm.com:8080/cmtpub/mvccon?troller?pEvent＝USER_LOGIN.html＊＊ The National Center for Biotechnology Information.Genes&Expression：[DB/OL].[2017-04-25].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.html.進行規范，分子效應指標數據參照NCBI-Gene and Protein＊＊＊ 中國中醫科學院中醫藥信息研究所.中國中醫藥主題詞表:[DB/OL].(2015-11-27)[2017-04-25].http://tcmks.cintcm.com:8080/cmtpub/mvccon?troller?pEvent＝USER_LOGIN.html＊＊ The National Center for Biotechnology Information.Genes&Expression：[DB/OL].[2017-04-25].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.html.進行規范。

1.4 統計學分析

對規范好的數據進行審核去重后，運用Excel 2010、Access 2010軟件進行頻次統計計算，運用Py?thon編程語言編寫的軟件進行計算，構建穴位-分子效應關系網絡，通過復雜網絡軟件Cytoscape3.3.0對網絡進行分析，并結合MCODE聚類插件對針刺部位-分子效應網絡進行化模塊聚類分析和可視化展示。

2 結果

2.1 分子和針刺部位的頻次統計

選取經過規范后的穴位數據和分子數據，對文獻ID進行去重合并，以確保每一篇文獻ID對應一個詞條。將穴位數據與分子數據通過唯一的文獻ID號進行匹配，去除同一文獻ID號下只有穴位或只有分子的條目，獲得最終有效數據。對所獲得的數據分別進行拆分并統計頻次，分別獲得與分子相匹配的針刺部位233個，分子793個，由高到低排序，分別選取兩項內容的前十項見表1。從表中可以看出針刺部位前十項累計頻次56.12%，其中頻次最高的是穴位足三里（722）；分子指標前十項累計頻次達22.87%，不足總指標數的1/3，且頻次大于100的只有兩項，分別為BCL2（抗凋亡基因）和FOS（原癌基因），說明分子指標較分散，反映出針刺實驗研究在分子水平的指標選擇是多樣的，并沒有很集中地研究某一指標的針刺效應。

2.2 針刺部位-分子關系網絡構建與分析

將穴位數據和分子數據以唯一的文獻ID號進行匹配關聯，分子和針刺部位作為網絡的結點，針刺部位和針刺部位、針刺部位和分子、分子和分子同時出現在同一篇文獻并且有確定效應關系時則形成一條邊，運用Python編程語言編寫的軟件進行計算，構建穴位-分子效應關系網絡，定義網絡中的三種關系分別為針刺穴位的配伍關系、分子之間的相關關系及針刺部位的分子效應關系，獲得一個含有1026個結點和8811條邊的網絡，此網絡結點度和邊權值較高的數據情況見表2和表3。

表1 針刺部位和分子頻次統計（前10項）

表2 針刺部位-分子網絡結點度排名前15項

表3 針刺部位-分子網絡三類邊權值排名前5項

表4 針刺部位-分子網絡中點度中心度、中間中心度、接近中心度都較大的結點

圖1 模塊1

在網絡中，結點度越高，則表示與這個結點相連的結點越多，說明此結點在網絡中處于中心位置。從表2可以看出，在針刺部位-分子網絡中，結點度最高的針刺部位是足三里穴，與其相鄰的結點有480個；結點度最高的分子是BCL2，與其相鄰的結點有98個，說明在此網絡中處于中心位置的穴位為足三里，處于中心位置的分子指標是BCL2。根據文獻報道[4-8]，BCL2是與細胞凋亡過程關系最密切的基因，屬于抗凋亡基因，通過調控其表達量，可以有效控制細胞的凋亡，針刺穴位可有效促進缺血狀態下BCL2的表達。

在網絡中，邊權值表示這條邊連接的兩個結點一同出現的頻率，邊權值越大，則兩結點同時出現的頻率越大。從表3三類邊權值排序可以發現以下幾點：第一，穴位共現頻次最高的是大椎和百會，并發現共現頻次較高的穴位亦是結點度較高的穴位，說明結點度較高的穴位常常相互配伍使用；第二，共現頻次最高的分子是BCL2和Bax，這兩個分子同屬凋亡基因家族，前者是抑凋亡基因，后者屬促凋亡基因，在研究過程中常常被同時觀測并計算兩者比值[9-12]；第三，分子和分子同時出現的頻率整體上低于穴位和穴位同時出現的頻率，因此可以推測針刺實驗在研究分子機制時對單個分子的研究較為普遍，而成族的研究較少；第四，從穴位和分子邊權值排序可以看出和BCL2最常同時出現的是百會穴，其次是足三里穴，表明在針刺實驗研究過程中常常選用百會穴和足三里穴來研究BCL2的變化。

為進一步研究此關系網絡的特征，將針刺部位-分子數據導入Cytoscape3.3.0軟件進行計算，得出該網絡的密度為0.017，網絡直徑為6，網絡集中化為0.452，網絡異質性為1.765，聚類系數為0.779，說明此網絡結點之間聯系相對緊密；最短路徑為1051650，平均路徑長度為2.554，說明該網絡符合復雜網絡的小世界性；孤立點數為0，說明此網絡為閉合型復雜網絡。

為了分析此網絡中每個結點的相互關系，本研究通過分析結點的點度中心度、接近中心度、中間中心度進行對結點個體的研究，由此了解結點個體在網絡中發揮的作用，即每個穴位或分子在網絡中與其他穴位或分子的關系。由于此網絡結點數較多，故這里只展示三中心度都較大的結點作為示例進行討論，見表4。

從表4中可以看出，三中心度都較大的結點均為穴位，說明在針刺實驗研究過程中不同的研究者在穴位的選取上是比較集中的；同時還反映出在網絡中表4中七個穴處于網絡的中心地位，并有很強的紐帶作用，表現為與其可配伍的穴位較多或其可調節的分子指標較多，并且在配伍性和調節程度上均強于其他穴位。為了更進一步地了解穴位配伍關系和其可調節的分子內容，本研究引入了復雜網絡的化模塊聚類分析算法來對此網絡進行模塊劃分。

2.3 針刺部位-分子網絡化模塊聚類結果分析

運用復雜網絡軟件Cytoscape3.3中的MCODE聚類插件計算針刺部位-分子效應網絡核心互作網絡模塊（Score＞2）。結果共獲得核心互作用模塊50個，其中Score＞10的有4個，見圖1-4。在模塊中，結點為穴位和分子，邊為結點之間的互作關系，其中穴位與穴位是配伍關系，分子與分子是相關關系，穴位與分子是調節關系。

圖2 模塊2

圖3 模塊3

圖4 模塊4

圖5 模塊2落入代謝通路（has01100：has01100:Metabolic pathways）的分子穴位關系網絡圖

從圖中可以看出，模塊1包含40個分子和4個穴位，涉及946個互作關系（MCODE Score=44）；模塊2包含56個分子和5個穴位，涉及915個互作關系（MCODE Score=30.5）；模塊3包含56個分子和12個穴位，涉及638個互作關系（MCODE Score=19.045）；模塊4包含26個分子和9個穴位，涉及206個互作關系（MCODE Score=12.118）。由此說明，模塊中的分子和穴位在整個網絡中互作用關系緊密，那么可以推測處于同一模塊中的分子大都有相同的功能，或者都與同一疾病有關，又或者屬于同一個生物通路。為了驗證推測，本研究借助DAVID數據庫*＊ National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID),NIH.DAVID Bioinformatics Resources 6.8:[DB/OL].[2017-04-25].https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp.html對這4個模塊中涉及到的分子進行分子功能注釋，從而了解其成族關系的具體內容。

將這四個模塊中涉及到的分子分別丟入DAVID數據庫中進行分子功能注釋，尋找與人類生理病理過程相關的基因及其代謝通路，并對結果結合臨床實際進行分析。結果顯示：模塊1有34個基因被找到，其中有21個基因分布在133個代謝通路中，聚集基因數較多的通路有4個；模塊2有44個基因被找到，其中有36個基因分布在163個代謝通路中，聚集基因數較多的通路有3個；模塊3有42個基因被找到，其中有38個基因分布在167個代謝通路中，聚集基因數較多的通路有2個；模塊4有21個基因被找到，其中有17個基因分布在106個代謝通路中，聚集基因數較多的通路有1個。部分結果詳見表5。

表5 針刺部位-分子網絡模塊分子功能注釋結果表

從表5中可以看出，相對于其他3個模塊，模塊2的分子之間功能更為集中，有1/3（12/36）的分子被聚集在代謝通路中（hsa01100:Metabolic pathways），其網絡關系圖見圖3。

圖中12個基因分別為線粒體ATP合酶（ATP5H）、腺苷酸激酶（adenylate kinase 1 AK1）、血小板激活因子乙酰水解酶1b催化亞基2（platelet activating factor acetylhydrolase 1b catalytic subunit 2 PAFAH1B2）、磷酸甘油酸酯變位酶1（phosphoglycerate mutase 1 PGAM1）、泛醌細胞色素 c還原酶（ubiquinol-cyto?chrome c reductase UQCRFS1）、磷酯酶Cβ1抗體（phos?pholipase C beta 1 PLCB1）、細胞色素c氧化酶亞基5 b（cytochrome c oxidase subunit 5B COX5B）、肌酸激酶B（creatine kinase B CKB）、過氧化物氧化還原酶6（per?oxiredoxin 6 PRDX6）、NME/NM23核苷二磷酸激酶1（NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 1 NME1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）、巖藻糖基轉移酶 4（fucosyl?transferase 4 FUT4），可以推測針刺穴位足三里、內關、水溝、粱門、四白可能會對代謝通路有所調節。同時，穴位足三里、粱門、四白屬于足陽明胃經腧穴，均可治療胃經疾病；內關為手厥陰心包經穴，是八脈交會穴之一，與陰維脈相通，陰維脈與足太陰脾經相通，故內關亦可治療脾胃腸疾病；水溝是急救要穴。那么可見這五個穴位均可用于治療脾胃腸系疾病及相關癥狀，可以推測針刺這些穴位治療疾病的生物學機制有可能是通過刺激這12個基因調節代謝通路，從而達到治療目的；亦可推測足陽明胃經和代謝通路關系密切，有待進行進一步的的研究來證實。

3 結論

本文運用復雜網絡的方法對針刺部位-分子網絡進行了計算分析，并引入MCODE算法，對網絡進行了模塊劃分，得到了穴位與分子之間更深層次的互作用關系，發現足三里穴是針刺實驗研究的最常用穴位，足陽明胃經可能與代謝通路關系密切，尤其是與一些相關生物因子相聯系，體現了中醫理論的現代化，為臨床及實驗研究提供新的研究思路。此外，本研究還發現針刺實驗研究對于分子水平的研究較為松散，相互之間聯系不緊密，此現象出現的原因可能是實驗研究對分子水平的研究較少且不成系列研究，針對這一可能的原因，在此后的研究過程中可以進一步在針刺對分子水平的調節發面深入并成系統研究。

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