黃芪多糖誘導乳腺癌細胞凋亡的實驗研究

張虹 季有波(通訊作者) 楊琪 孫曉琪 冷雪

130031長春醫學高等專科學校臨床醫學部1

130041吉林大學第二醫院骨科醫學中心2

130021吉林大學第一醫院放射線科3

黃芪多糖誘導乳腺癌細胞凋亡的實驗研究

張虹1季有波(通訊作者)2楊琪3孫曉琪1冷雪1

130031長春醫學高等專科學校臨床醫學部1

130041吉林大學第二醫院骨科醫學中心2

130021吉林大學第一醫院放射線科3

目的：探討黃芪多糖誘導乳腺癌細胞凋亡的作用。方法：應用形態學觀察和流式細胞術等方法對黃芪多糖處理的人乳腺癌細胞進行檢測和觀察。結果：黃芪多糖處理后48 h細胞具有典型的凋亡細胞形態特征；Western Blot結果顯示，黃芪多糖處理后細胞的凋亡標志蛋白PARP降解產物增加。結論：黃芪多糖可以誘導MCF-7細胞凋亡。

黃芪多糖；乳腺癌；細胞凋亡

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤。有學者認為，黃芪多糖可直接殺傷腫瘤細胞[1，2]，并能誘發腫瘤細胞凋亡[3，4]。本研究探討黃芪多糖誘導人乳腺癌細胞凋亡作用，為黃芪多糖的臨床應用提供科學的、客觀的理論依據。

資料與方法

細胞培養：人乳腺癌細胞系MCF-7，在含10%胎牛血清(BI)的DMEM培養基，37℃，5%CO2空氣及飽和濕度條件下培養。以7×105個細胞接種于6 cm培養皿中培養過夜，次日加入相應濃度的黃芪多糖。

試驗分組：①試驗組：黃芪多糖用量0.75 mg/mL、1.5 mg/mL、3 mg/mL。②對照組：阿霉素組0.1 μmol/L及空白對照。

試劑：黃芪多糖為天津賽諾制藥有限公司產品；DMEM培養基、PI、胰蛋白酶購自ThermoFisher；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RNase購自 Sigma；DMSO 購自Amresco；蘇木精、伊紅和姬姆薩染液等。

試驗方法：①光鏡形態學觀察：將細胞以2×105個/孔接種于含蓋玻片的6孔板中，培養48 h后，試驗組加入含0.75、1.5、3mg/mL黃芪多糖的培養液，陰性對照組僅加培養液，每孔內液體終體積為1.5 mL。培養72 h后，取出蓋玻片，常規HE染色，高倍顯微鏡下計算5個不同視野的陽性細胞百分比，然后計算出平均值作為該標本的陽性細胞百分比。②Western Blot檢測凋亡標志物PARP降解產物(cleaved-PARP)：細胞經黃芪多糖處理后48 h，收集細胞，加入200 μL含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上作用30 min，14 000 rpm離心15 min，收集上清液。BCA方法測蛋白濃度。利用SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離并通過電場將蛋白質轉移到PVDF膜上，PVDF膜于室溫置于含5%去脂奶粉的PBS-TWEEN溶液中封閉1 h，然后于4℃冰箱中將PVDF膜與抗PARP抗體孵育過夜；用PBS-TWEEN溶液洗膜3次，5 min/次；于室溫將PVDF膜與二抗孵育1 h，用PBS-TWEEN溶液洗膜3次。用ECL發光液曝光與抗體結合的蛋白條帶。③Ac-DEVD-CHO對黃芪多糖誘導的細胞凋亡的影響：將細胞以3×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后，試驗組先加入1 mg/mL的Ac-DEVD-CHO；對照組和空白組加入培養液。每組各設4個平行孔，培養1 h后，試驗組加入含1.5 mg/mL、3 mg/mL黃芪多糖的培養液，每孔內液體終體積為100 μL。培養72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，37℃繼續孵育4 h，棄上清液，每孔加入100 μL DMSO混勻，酶標儀(λ=570 nm)測定光吸收值(OD值)，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=試驗組OD值/對照組OD值×100%。

結 果

形態學觀察：不同劑量的黃芪多糖作用下，經HE染色，光學顯微鏡下可見MCF-7細胞縮小，胞膜完整，染色質被濃染，顏色加深，體積變小。試驗組與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

Western Blot檢測細胞凋亡：1.5 mg/mL和3 mg/mL黃芪多糖作用細胞48 h后，均明顯可見凋亡蛋白標志物89 kDa的PARP降解產物表達，對照組和0.75 mg/mL組只觀察到116 kDa的蛋白條帶。說明黃芪多糖可以誘導MCF-7細胞凋亡，并且凋亡呈劑量依賴性增加，見圖1。

Ac-DEVD-CHO對黃芪多糖誘導的細胞凋亡的影響：Caspase-3是凋亡的執行者，加入Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO抑制了細胞中Caspase-3的活性，細胞凋亡則無法執行，因此細胞生存率明顯上升。本結果進一步驗證了黃芪多糖具有誘導MCF-7細胞凋亡的作用，見表2。

討 論

乳腺的生長和發育與細胞凋亡密切相關[5]。細胞凋亡是乳腺癌發生、治療及預后研究中的重要領域[6，7]。

本研究使用Western Blot和光鏡方法觀察了黃芪多糖對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響。結果顯示，黃芪多糖可誘導MCF-7細胞凋亡，且誘導MCF-7細胞凋亡能力隨藥物濃度的增加而增強。但黃芪多糖誘導MCF-7細胞凋亡的分子機制還有待于進行進一步的探討。

本研究結果顯示，黃芪多糖對于抗乳腺癌具有確切效果，為黃芪多糖在抗乳腺癌領域中的應用提供科學依據，為中醫藥走向國際市場打下堅實基礎。

表1 黃芪多糖對MCF-7細胞凋亡的影響(±s)

表1 黃芪多糖對MCF-7細胞凋亡的影響(±s)

劑量(mg/mL) 凋亡細胞率(%)0 6.8±1.79 0.75 7.8±1.92 1.5 13.0±2.55 3 25.4±2.97

表2 加CHO前后黃芪多糖對MCF-7細胞生存率的影響

圖1 Western Blot檢測細胞凋亡

[1]黃惠風,錢建業.黃芪多糖對人胃癌細胞MKN45誘導凋亡和細胞周期的影響[J].實用臨床醫藥雜志,2010,14(19):17-20.

[2]黃宏思,黃衍強.黃芪多糖協同紫杉醇對腫瘤細胞的殺傷作用[J].右江民族醫學院學報,2010,9(1):3-5.

[3]李蓉,譚小武.黃芪多糖誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究進展[J].中國現代中藥,2015,17(6):627-629.

[4]謝少茹,沈洪.黃芪多糖對胃癌細胞的生長抑制和促凋亡作用[J].河北中醫,2009,31(9):1373-1378.

[5]王迪,張虹.逍遙散誘導乳腺癌細胞凋亡實驗研究[J].遼寧中醫雜志,2009,36(3):472-473.

[6]谷俊朝,余微波.黃芪多糖對TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生長及HSP70表達的影響[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(20):1534-1537.

[7]趙相軒,溫鋒.細胞凋亡在乳腺癌治療中的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志,2017,22(2):175-179.

Experimental study on apoptosis of breast cancer cells induced by Astragalus Polysaccharides

Zhang Hong1,Ji Youbo(Corresponding author)2,Yang Qi3,Sun Xiaoqi1,Leng Xue1
Department of Clinical Medicine,Changchun Medical College 1300311
Department of Orthopedics Medical Center,the Second Hospital Affilitted to Jilin University 1300412
Department of Radiology,the First Hospital Affilitted to Jilin University 1300213

Fund projectScience and technology research project of Jilin provincial education department in"12th Five-Year Plan"《Experimental study of Astragalus Polysaccharides on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7》

Objective:To investigate the apoptosis of breast cancer cells induced by Astragalus polysaccharides.Methods:Morphological observation and flow cytometry were used to detect and observe the human breast cancer cells treated with Astragalus polysaccharides.Results:It showed typical morphological characteristics of apoptotic cells after treated with Astragalus polysaccharides for 48 hours.Western blot results showed that the apoptosis marker protein PARP degradation products increased after the treatment with Astragalus polysaccharides.Conclusion:Astragalus polysaccharides can induce apoptosis of MCF-7 cells.

Astragalus polysaccharides;Mammary cancer;Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.34.1

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究課題《黃芪多糖對人乳腺癌細胞MCF-7抑制增殖和誘導凋亡作用的實驗研究》