外源性硫化氫對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響及機制

曾奇虎，楊萍，翁靜飛，王家偉，劉星，范忠才

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

外源性硫化氫對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響及機制

曾奇虎，楊萍，翁靜飛，王家偉，劉星，范忠才

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的探討外源性硫化氫(H2S)對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響及其機制。方法將27只健康雄性SD大鼠腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)建立2型糖尿病模型，8周后建立糖尿病腎病模型。選取糖尿病腎病模型大鼠20只，另選取正常大鼠20只，分為正常對照組(Control+saline組)、H2S對照組(Control+NaHS組)、模型組(DN+saline組)、H2S治療組(DN+NaHS組)，每組10只。予以DN+saline組和Control+NaHS組大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol/(kg·d)，予以Control+saline組和DN+saline組腹腔注射等量生理鹽水。持續8周后，收集24 h尿液，采用考馬斯亮藍G-250法檢測24 h尿蛋白定量(24 h Upro)；心臟采血、留取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平；取腎臟組織，采用HE染色法觀察腎臟組織病理學表現，Western blotting法檢測腎臟組織轉化生長因子β1(TGF-β1)、Smad7蛋白表達，免疫組化法檢測腎臟纖維化相關蛋白纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-SMA)表達。結果與Control+saline組相比，DN+saline組大鼠BUN、SCr和24 h Upro升高(P均<0.05)，腎臟病理損傷明顯加重，腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA、TGF-β1蛋白表達上調(P均<0.05)，Smad7蛋白表達下調(P<0.05)；與DN+saline組相比，DN+NaHS組大鼠BUN、SCr、24 h Upro降低(P均<0.05)，腎臟病理損傷明顯減輕，腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA、和TGF-β1蛋白表達下調(P均<0.05)，Smad7蛋白上調(P均<0.05)。結論外源性H2S可明顯改善糖尿病腎病大鼠的腎纖維化，其機制可能與調控TGF-β1/Smad7信號通路有關。

糖尿病腎病；硫化氫；轉化生長因子β1；Smad7蛋白；腎間質纖維化

糖尿病腎病是糖尿病最重要的微血管并發癥之一，也是導致終末期腎病最重要的原因之一。目前認為，纖維化和炎癥在糖尿病腎病發展中起關鍵性作用，是導致糖尿病腎病最重要病理機制和途徑。內源性硫化氫(H2S)是由半胱氨酸在多種酶催化作用下產生的氣體信號分子，具有松弛血管、抑制血管平滑肌細胞增殖、調節血管平滑肌細胞張力、保護腎臟及心臟等重要器官的作用[1]，而且外源性H2S亦對心血管疾病具有保護作用[2]。近年研究發現，H2S可能通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等信號通路，減輕糖尿病腎病大鼠腎臟氧化應激、炎癥、系膜細胞增殖，從而改善糖尿病腎病大鼠的腎臟功能[3,4]。轉化生長因子β1(TGF-β1)是一種多功能細胞因子，參與調控多種細胞的免疫、生長、分化、凋亡、自噬、腫瘤抑制等生物進程。研究證實，調控TGF-β1下游信號分子Smads蛋白可影響ɑ-SMA介導的腎間質性纖維化過程，從而參與調控糖尿病腎病進程[5]。但目前，對于外源性H2S在糖尿病腎病治療中的作用及機制尚不明確。2016年10月～2017年4月，我們通過建立2型糖尿病腎病大鼠模型，探討外源性H2S治療糖尿病腎病的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 SPF級成年健康雄性SD大鼠47只，10～16周齡，體質量200～220 g，由西南醫科大學動物實驗中心提供，飼養期間自由進食和飲水。鏈尿佐菌素(STZ)、NaHS(作為外源性H2S供體)購自美國Sigma公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體、Smad7兔抗大鼠多克隆抗體、纖維連接蛋白(FN)兔抗大鼠單克隆抗體、層粘連蛋白(LN)兔抗大鼠單克隆抗體、ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-SMA)兔抗大鼠單克隆抗體均購自Abcam公司；BCA蛋白測定試劑盒、RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)等Western blotting試劑盒及免疫組化SP試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。本研究經醫院倫理委員會批準，符合動物倫理相關規定。

1.2 糖尿病模型建立、分組及處理 動物適應性喂養1周，取27只大鼠予以高糖高脂(10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黃粉、61%常規飼料)喂養4周，禁食12 h后，腹腔單次注射STZ 40 mg/kg，注射后3 d采尾靜脈血測血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病模型成功后繼續以普通飼料喂養8周，建立糖尿病腎病模型。選取糖尿病腎病模型大鼠20只、正常大鼠20只，采用隨機數字表法分為正常對照組(Control+saline組)、H2S對照組(Control+NaHS組)、模型組(DN+saline組)、H2S治療組(DN+NaHS組)各10只。予以DN+NaHS組和Control+NaHS組大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol/(kg·d)，Control+saline組和DN+saline組腹腔注射等量生理鹽水，持續8周。

1.3 24 h尿蛋白定量(24 h Upro)測定 末次給藥后收集24 h尿液，分裝保存，采用考馬斯亮藍G-250法檢測24 h Upro。

1.4 血清腎功能指標測定 收集尿液后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，心臟采血、離心、留取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。

1.5 腎臟組織病理觀察 取血后收集腎臟標本，4%多聚甲醛固定，制作3 μm石蠟切片，采用HE染色法在光鏡(×200倍)下觀察腎臟組織病理學表現。

1.6 腎臟組織TGF-β1、Smad7蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取-80 ℃保存的腎臟組織，每100 mg加入預冷組織裂解液1 mL，超聲破碎儀中(冰浴)勻漿后離心取上清液，使用BCA法檢測蛋白濃度。充分混合的上清加5×蛋白上樣緩沖液后于100 ℃煮沸變性10 min，保存于-20 ℃冰箱。將變性好的組織樣品冰上溶解后以20 μL總蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳后使用半干法轉膜至PDVF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗去封閉液，洗膜3次，分別加稀釋一抗兔抗大鼠TGF-β1(1∶1 000)、Smad7(1∶1 000)4 ℃孵育過夜， HRP標記的羊抗兔二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色、曝光。應用Quantity One軟件分析目的條帶光密度值(OD)，使用GAPDH條帶進行OD校正。

1.7 腎臟組織纖維化相關蛋白表達檢測 采用免疫組化法檢測腎臟纖維化相關蛋白FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達。腎臟組織石蠟切片脫水、包埋、切片(3 μm)，按照SP法試劑盒操作說明書檢測腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達。FN、LN、ɑ-SMA蛋白在細胞質或細胞核中呈棕黃色顆粒為陽性，應用Image Pro Plus 6.0軟件計算各組平均吸光度值(AOD)。

2 結果

2.1 各組腎功能指標及24 h Upro比較 與Control+saline組比較，DN+saline組和DN+NaHS組BUN、SCr、24 h Upro均增高(P均<0.05)。與DN+saline組比較，DN+NaHS組BUN、SCr、24 h Upro均降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組腎臟組織病理學變化 Control+saline組和Control+NaHS組大鼠腎小管排列整齊， 腎間質無異常改變，無纖維組織增生，腎小管管腔內無結晶物沉積。與Control+saline組比較，DN+saline組可見大量腎小管上皮細胞脫落或空泡樣變性，腎小管明顯擴張，且存在萎縮的腎小管，腎小球明顯萎縮，腎小管內有蛋白管型，腎間質纖維化增生及大量炎性細胞浸潤；與DN+saline組比較，DN+NaHS組腎小球萎縮程度、腎小管擴張、腎間質纖維化程度均減輕。

表1 各組腎功能指標及24 h Upro比較

注：與Control+saline組比較，*P<0.05；與DN+saline組比較，﹟P<0.05。

2.3 各組腎臟組織TGF-β1、Smad7蛋白表達比較 與Control+saline組比較，DN+saline組腎臟組織TGF-β1表達增加、Smad7表達降低(P均<0.05)；與DN+saline組比較，DN+NaHS組腎臟組織TGF-β1表達降低、Smad7表達增加(P均<0.05)，見表2、圖1。

2.4 各組腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達比較 DN+saline組腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達較Control+saline組增加(P均<0.05)， DN+NaHS組FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達均低于DN+saline組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組腎臟組織TGF-β1、Smad7、FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達比較

注：與Control+saline組比較，*P<0.05；與DN+saline組比較，﹟P<0.05。

圖1 各組腎臟組織TGF-β1及Smad7蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病主要并發癥，是導致糖尿病患者死亡的重要原因。糖尿病腎病的病理變化主要表現為腎小球系膜增生、基底膜增厚、腎間質纖維化、腎小管萎縮等，導致細胞外基質成分的異常沉積，從而導致腎衰竭。腎纖維化是多種疾病導致腎衰竭的常見病理特征，是各種原因所致的腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同通路。由于糖尿病腎病多存在復雜的代謝紊亂，往往比其他原因所致的腎臟疾病進展更快，一旦進展到終末期腎衰竭，需行腎臟替代治療，治療費用高，病死率高，因此延緩糖尿病腎病意義重大。

H2S 是新發現的第三類氣體信號分子，是高效的細胞色素 C 氧化酶抑制劑，對機體新陳代謝具有意義深遠的影響，對腎臟具有保護作用[1]。研究發現，H2S可通過改善胰島素抵抗，降低血糖，改善血脂水平，從而減輕腎臟損傷[6]。H2S也可通過調節氧化應激和多元醇通路保護腎臟[7]，說明外源性H2S可能通過多個靶點或信號通路延緩糖尿病腎病進展，機制復雜，具體機制尚不明確。本研究發現，與Control+saline組比較，DN+saline組BUN、SCr、24 h Upro均增高，腎臟組織可見大量腎小管上皮細胞脫落或空泡樣變性，腎小管明顯擴張，且存在萎縮的腎小管，腎小球明顯萎縮，提示糖尿病腎病大鼠出現腎臟腎間質纖維化且腎功能、尿蛋白明顯惡化；與DN+saline組相比較，DN+NaHS組BUN、SCr、24 h Upro均降低，腎小球萎縮程度、腎小管擴張、腎間質纖維化程度均減輕，提示外源性H2S能提高糖尿病腎病大鼠的腎臟功能、改善腎臟組織病理改變。

TGF-β1是參與糖尿病腎病進展關鍵的纖維細胞因子，TGF-β1信號通路可通過調節細胞外基質基因調控和聚集，加速腎小球硬化、腎小管及間質纖維化，在腎纖維化的發展中起著中樞調節作用[8]。因此，TGF-β1信號通路的誘導和激活對纖維細胞反應的觸發至關重要。研究表明，抑制TGF-β1表達可以減少細胞外基質在糖尿病腎病腎臟聚集，可以通過介導腎小球及腎小管機制降低尿蛋白[9,10]。Smad7是TGF-β1/Smads信號通路關鍵分子，通過與TGF-β1受體結合阻止招募Smad3、Smad2及其磷酸化，改善糖尿病腎病大鼠的腎臟纖維化[11,12]。本研究發現，DN+NaHS組腎臟組織TGF-β1蛋白表達較DN+saline組下調，而Smad7明顯上調，提示H2S可通過下調TGF-β1和上調Smad7，減少細胞外基質聚集而改善腎間質纖維化，從而延緩糖尿病腎病進展。

FN在腎小球中主要由系膜細胞產生，具有結合細胞外基質各類成分并促進細胞外基質其他成分沉積的作用。FN異常增高提示細胞外基質過度積聚，是糖尿病腎病腎間質纖維化的主要表現之一。LN作為基底膜的主要組分，可與Ⅳ型膠原相互作用，介導細胞的附著、遷移和在組織中的有序化，對基膜的組裝起關鍵性作用。α-SMA是血管平滑肌特有的細胞骨架蛋白，是成肌纖維細胞特征性標志物，參與腎間質纖維化，影響糖尿病腎病發生與進展。研究發現，TGF-β1/Smads信號通路可以通過上調α-SMA表達，加重腎間質纖維化，從而導致腎功能下降[13～15]。本研究發現，DN+saline組大鼠腎臟LN、FN、α-SMA蛋白表達較Control+saline組明顯升高，表明糖尿病腎病大鼠腎間質纖維化程度明顯增加；與DN+saline組相比較，DN+NaHS組大鼠腎臟中LN、FN、α-SMA蛋白表達明顯減少，由此推測，H2S可能通過調控FN、LN、α-SMA，減輕細胞外基質的過度積聚，抑制系膜細胞的異常增生，減輕腎小球基底膜增厚和系膜的擴張，改善糖尿病腎病大鼠腎纖維化病變，可能與其調控TGF-β1/Smads信號通路有關。

綜上所述，外源性H2S可能通過調控TGF-β1/Smad7信號通路改善糖尿病腎病大鼠腎纖維化，進而發揮保護腎臟效應，為2型糖尿病腎病治療提供了新的途徑和靶點。本研究僅初步探討了外源性H2S對2型糖尿病腎病的作用及機制，今后尚需對TGF-β1/Smad7信號通路下游信號分子及其他通路參與介導外源性H2S對腎臟保護作用的機制進行深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.009

R587.2

A

1002-266X(2017)46-0034-04

四川省科學技術廳-瀘州市人民政府-瀘州醫學院聯合科研專項資金資助項目(0903-100020802) 。

范忠才(E-mail: zhongcai9665@126.com)

2017-06-12)