藏紅花酸預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機制探討

逯鵬，王佳森，姜善紅，李愛群，姚寶洪，王占青，施真

(濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺264100)

藏紅花酸預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機制探討

逯鵬，王佳森，姜善紅，李愛群，姚寶洪，王占青，施真

(濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺264100)

目的探討藏紅花酸對心肌缺血/再灌注(I/R)損傷大鼠心肌組織的影響及其機制。方法選擇30只雄性Wistar大鼠，隨機分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(MI/R組)及藏紅花酸預處理組(CRO組)各10只。Sham組、MI/R組均予0.5% CMC-Na 10 mL/(kg·d)灌胃預處理，CRO組予0.5%藏紅花酸50 mg/(kg·d)灌胃預處理。干預7 d后，MI/R組、CRO組均開胸結扎冠狀動脈前降支45 min，再灌注180 min，建立心肌I/R損傷模型；Sham組開胸后，于冠狀動脈前降支穿線但不予結扎。造模結束后，腹主動脈抽血分離血清，采用膠體金法測定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白I(cTnI)水平。取心肌組織，采用HE染色法觀察心肌細胞病理變化，采用免疫組織化學SV超敏兩步法檢測心肌細胞色素C(CytC)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)蛋白表達。結果Sham組心肌間質無炎性細胞浸潤，心肌纖維排列整齊；MI/R組可見心肌組織明顯壞死區，心肌間質出現大量炎性細胞浸潤；CRO組心肌組織壞死及炎細胞浸潤較MI/R組明顯減輕。MI/R組血清CK-MB、cTnI水平均高于Sham組，CRO組血清CK-MB、cTnI水平均低于MI/R組(P均<0.05)。MI/R組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達均高于Sham組(P均<0.05)，CRO組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達均低于MI/R組(P均<0.01)。結論藏紅花酸預處理可明顯減輕大鼠心肌I/R損傷，其機制可能與抑制CytC/Caspase-9蛋白表達有關。

藏紅花酸；心肌缺血；缺血再灌注損傷；細胞色素C；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9

冠心病是指冠狀動脈粥樣硬化導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，快速有效地恢復缺血心肌的再灌注，是治療的最根本措施[1]。但恢復正常的血流灌注后，缺血區的損傷反而加重，引發心肌缺血/再灌注(I/R)損傷[2]。如何減少乃至消除心肌I/R損傷，是目前冠心病血管再通治療中急需解決的難題。因此，尋找可用于治療心肌I/R損傷的有效藥物，對于冠心病血管再通治療具有重要意義。藏紅花酸是藏紅花提取物的主要活性成分之一，屬類胡蘿卜素物質，具有多不飽和共軛烯酸結構，既往研究表明其具有防止動脈粥樣硬化、抑制腫瘤細胞增殖、清除氧自由基等作用[3，4]。本課題組前期研究表明，藏紅花可以通過抑制細胞凋亡，減輕心肌I/R損傷[5～7]。研究表明，細胞色素C(CytC)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)信號通路介導了心肌缺血損傷細胞的凋亡過程[8]。但目前，藏紅花酸對心肌I/R損傷的影響及其機制是否與CytC/Caspase-9有關尚不明確。2013年7月～2014年5月，我們對心肌I/R損傷模型大鼠采用藏紅花酸預處理，探討藏紅花酸預處理對心肌I/R損傷的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 成年健康雄性Wistar大鼠30只，體質量(220±20)g，購自山東大學實驗動物中心。藏紅花酸試劑購自濟南浩化實業有限責任公司，使用前應用羧甲基纖維素鈉制成0.5%的懸浮液；羧甲基纖維素鈉購自Sigma公司；血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒、CytC及Caspase-9抗兔免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德公司；兔抗大鼠多克隆抗體購自蘇州Immunoway公司。本實驗通過濱州醫學院倫理委員會批準。

1.2 動物分組及藥物預處理 采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(MI/R組)及藏紅酸預處理組(CRO組)，每組各10只。Sham組、I/R組均予0.5% CMC-Na 10 mL/(kg·d)灌胃預處理，CRO組予0.5%藏紅花酸50 mg/(kg·d)灌胃預處理，各組均干預7 d。

1.3 模型制備 各組干預7 d后，MI/R組、CRO組均制備心肌I/R損傷模型。大鼠禁食6 h，20%烏拉坦8 mL/kg腹腔注射麻醉，應用Medlab信號采集系統，記錄Ⅱ導聯心電圖。于胸骨左緣0.5 cm處剪開胸部皮膚，分離胸大肌和胸小肌，暴露胸腔，剪開心包膜后將心臟擠出胸腔，自左心耳與肺動脈圓錐交界處下約3.5 cm進針穿線，結扎冠狀動脈左前降支，同時將半徑為1 mm的聚乙烯管置于結扎線與冠狀動脈之間，拉緊結扎線使冠狀動脈閉塞，以心電圖出現ST段顯著抬高視為結扎成功。45 min后取出聚乙烯管，以心臟表面顏色由蒼白色轉變為紅色及抬高的ST段下降≥1/2為再灌注成功標志，然后心肌再灌注180 min，建立心肌I/R損傷模型。Sham組以同樣方法開胸后，于冠狀動脈前降支穿線但不予結扎。

1.4 血清CK-MB及cTnI水平檢測 造模結束后，經腹主動脈穿刺抽血3 mL，離心分離出血清。采用膠體金法測定血清CK-MB及cTnI水平，嚴格按試劑操作說明書的實驗步驟進行檢測。同一樣品設置3個平行對照，每組樣品獨立重復3次。

1.5 心肌組織病理觀察 各組造模后，取心肌組織，石蠟包埋切片，常規HE染色，奧林巴斯BX41金相顯微鏡下觀察心肌細胞病理變化。

1.6 心肌組織CytC及Caspase-9蛋白檢測 取血后，取心肌組織，石蠟包埋切片。采用免疫組織化學SV超敏兩步法檢測心肌CytC及Caspase-9蛋白表達。一抗用PBS 緩沖液稀釋(1∶200)。具體步驟按SP試劑盒說明書操作。采用Matic Images Advanced 3.2圖像分析系統采集圖片，每張切片隨機選取5個視野，通過計算OD值對各組CytC和Caspase-9蛋白表達進行定量。

2 結果

2.1 各組血清CK-MB及cTnI水平比較 MI/R組血清CK-MB、cTnI水平均高于Sham組，CRO組血清CK-MB、cTnI水平均低于MI/R組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清CK-MB及cTnI水平比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與MI/R組比較，#P<0.05。

2.2 各組心肌組織病理變化 Sham組心肌間質無炎性細胞浸潤，心肌纖維排列整齊。MI/R組可見明顯壞死區，心肌間質出現大量炎性細胞浸潤，心肌纖維腫脹、紊亂。CRO組見少量炎細胞浸潤，心肌細胞胞核大小均勻，心肌纖維輕度腫脹，與MI/R組相比，心肌炎癥浸潤明顯減輕，心肌局灶性壞死明顯較少。

注：A為Sham組；B為MI/R組；C為CRO組。

2.3 各組心肌組織CytC及Caspase-9蛋白表達比較 CytC及Caspase-9陽性表達主要定位于細胞質內，陽性表達細胞被染成棕黃色。MI/R組細胞質中CytC及Caspase-9蛋白表達呈深棕黃色，較Sham組顏色深；CRO組CytC及Caspase-9蛋白表達呈棕黃色，較MI/R組顏色淺。MI/R組心肌CytC、Caspas-9蛋白表達均高于Sham組(P均<0.05)，CRO組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達均低于MI/R組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組心肌組織中CytC及Caspase-9蛋白表達比較

注：與Sham組比較，*P<0.05；與MI/R組比較，#P<0.01。

3 討論

心肌I/R損傷是缺血損傷的延續、擴大和惡化，是彼此獨立而又互相聯系的病理生理過程[2]。再灌注過程中，隨著缺血心肌血流的重建，左心室功能將得到改善，此時合理應用抗心肌I/R損傷藥物將增強心肌細胞抗再灌注損傷的能力，從而大大降低心肌I/R損傷帶來的危害。因此，心肌I/R的防治要從缺血期開始，盡快解除機體缺血狀況對減輕因缺血造成的損傷有著非常重要的臨床意義。

藏紅花酸是鳶尾科番紅花屬藏紅花柱頭中的主要化學成分，研究證明藏紅花酸具有抗動脈粥樣硬化以及減輕腦I/R損傷的作用。Ishizuka等[8]研究表明，藏紅花酸通過減少氧化應激和抑制凋亡進而抑制小鼠視網膜的缺血性損傷；也有研究證實藏紅花酸可以通過抑制凋亡來減輕實驗性失血性休克導致的干細胞凋亡[9]、通過PI3K/Akt/eNOS通路抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞的凋亡[10]等。但尚沒有藏紅花酸對于心肌I/R導致的心肌細胞凋亡方面的研究。本研究發現，MI/R組心肌組織可見明顯壞死區，心肌間質出現大量炎性細胞浸潤，心肌纖維腫脹、紊亂，而CRO組心肌壞死及炎癥浸潤較MI/R組明顯減輕，提示藏紅花酸可以保護心肌I/R損傷導致的心肌損害。

心肌I/R損傷過程中，由于心肌細胞膜通透性的改變導致細胞內CK-MB漏出增加，因此臨床上常用檢測血清CK-MB含量評估心肌缺血損傷。cTnI是心肌損傷特異性標志蛋白[11]。本研究發現，MI/R組血清CK-MB、cTnI水平均高于Sham組，CRO組血清CK-MB、cTnI水平均低于MI/R組，提示藏紅花酸可以改善心肌細胞膜通透性、減輕心肌細胞的損傷。

近年研究發現，心肌I/R損傷的機制有氧自由基過多[12]、鈣超載[13]、能量代謝障礙以及細胞凋亡[14,15]等。實驗研究表明，CytC從線粒體內釋放出來是細胞凋亡的重要步驟[16]。釋放到細胞質中的CytC在dATP存在的條件下，能與凋亡相關因子1(Apaf-1)結合，形成多聚體之后與Caspase-9結合，一方面形成凋亡小體，另一方面可同時激活Caspase-9，進而激活如Caspase-3等的其他Caspase，從而誘導細胞凋亡。此外，線粒體還通過釋放凋亡誘導因子參與激活Caspase。因此，CytC從線粒體釋放到細胞質，并進而激活Caspase-9，是細胞凋亡研究的關鍵問題。近年來，藏紅花酸抑制細胞凋亡機制已成為心肌I/R研究的熱門。本課題組前期研究表明，藏紅花酸可抑制缺血再灌注損傷心肌細胞的凋亡[5～7]。本研究發現，MI/R組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達均高于Sham組，CRO組心肌CytC、Caspase-9蛋白表達均低于MI/R組，提示藏紅花酸可降低心肌I/R損傷后心肌CytC、Caspase-9蛋白表達，可能與藏紅花酸抑制I/R損傷、發揮保護心肌細胞的作用有關。

綜上所述，藏紅花酸預處理可明顯減輕心肌I/R損傷大鼠的心肌損傷，其機制可能是通過抑制CytC/Caspase-9蛋白的活化，從而抑制I/R損傷、發揮保護心肌細胞的作用。本研究為藏紅花酸在心肌I/R損傷治療中的應用及臨床治療方案的優化提供了依據。

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山東省煙臺市科技發展計劃(2012108)。

王佳森(E-mail:) 施真(E-mail: zhen_shizhen@163.com)

2017-05-10)