結核抗體檢測聯合結核感染T細胞斑點試驗的臨床診斷價值

劉佳文 呂紅艷

·論著·

結核抗體檢測聯合結核感染T細胞斑點試驗的臨床診斷價值

劉佳文 呂紅艷

目的探討結核抗體檢測聯合結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)在結核病診斷中的應用價值。方法選擇2016年1月1日至2017年4月12日就診于北京老年醫院的961例結核病患者[結核病組；包括364例菌陽肺結核患者(通過細菌學診斷確診)和597例菌陰肺結核患者(通過臨床進行診斷)]和非結核病的1046例患者(對照組)。所有患者同時使用上海奧普生物醫藥有限公司及新加坡MP生物醫學亞太私人有限公司生產的結核抗體金標試劑(分別為TB-DOT、ASSURE TB試劑盒)檢測血清中的結核抗體；961例結核病組中的574例及1046例對照組中的664例患者同時使用T-SPOT.TB試劑盒和2種結核抗體金標試劑進行檢測。對兩組患者采用3種實驗室技術進行檢測或聯合檢測(包括串聯與并聯)，對檢測結果的敏感度、特異度進行統計學分析。結果TB-DOT和ASSURE TB檢測結核病組和對照組患者的敏感度和特異度分別為52.86%(508/961)、74.95%(784/1046)和45.99%(442/961)、76.00%(795/1046)。TB-DOT 和ASSURE TB對菌陽和菌陰肺結核患者檢測的敏感度分別為64.84%(236/364)、62.09%(226/364)和45.56%(272/597)、36.18%(216/597)；菌陽肺結核患者TB-DOT和ASSURE TB檢測的敏感度均高于菌陰肺結核患者，差異均有統計學意義(χ2值分別為60.99、33.69，P值均<0.05)。結核病組和對照組患者在2種結核抗體金標試劑和T-SPOT.TB試劑盒的串聯聯合檢測中，敏感度為24.04%(138/574)，但特異度達到89.91%(597/664)；并聯聯合檢測中，特異度為21.23%(141/664)，但敏感度達到89.55%(514/574)。結核病組和對照組在ASSURE TB、TB-DOT和T-SPOT.TB 3種檢測方法中，均為陽性和均為陰性兩種譜型的構成比分別為24.04%(138/574)、10.09%(67/664)和10.45%(60/574)、21.23%(141/664)，差異均有統計學意義(χ2值分別為43.37和26.32，P值均<0.05)。結論兩種結核抗體與T-SPOT.TB行串聯聯合檢測能夠提高檢測特異度，并聯聯合檢測能夠提高檢測敏感度；串聯聯合檢測時，3種檢測方法結果均為陽性和均為陰性兩種譜型在臨床上對結核病血清學診斷具有輔助診斷價值。

結核； 抗體； 干擾素γ； 試劑盒,診斷； 診斷技術和方法； 數據說明,統計

近年來，血清學(抗原、抗體、蛋白芯片)檢測方法診斷活動性結核病和肺外結核，在國內外重新得到重視和研究，對其臨床意義和價值有了新的評價，認為血清學檢測依然是結核病輔助診斷的重要手段之一[1]。

本研究通過回顧性分析，評價兩種結核抗體檢測試劑[上海奧普生物醫藥有限公司生產的結核抗體金標試劑(TB-DOT)和新加坡MP生物醫學亞太私人有限公司生產的結核抗體金標試劑(ASSURE TB)]與結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)聯合檢測在結核病輔助診斷中的臨床價值。

資料和方法

一、研究對象及診斷標準

1.研究對象：回顧性分析2016年1月1日至2017年4月12日就診于北京老年醫院結核門診和住院患者中同時采用TB-DOT和ASSURE TB兩種結核抗體進行診斷的2007例患者。2007例患者中，診斷為結核病的患者961例(其中，菌陽肺結核患者364例，均通過細菌學診斷確診；菌陰肺結核患者597例，均通過臨床進行診斷；961例患者中同時行T-SPOT.TB檢測的患者574例)，診斷為非結核病的患者1046例(同時行T-SPOT.TB檢測的患者664例)。

2.分組情況：(1)結核病組：共961例；其中男644例，女317例，年齡13～94歲，平均年齡(50.33±22.09)歲。961例患者中，菌陽肺結核患者364例，其中男261例，女103例，年齡14～91歲，平均年齡(51.52±22.55)歲；菌陰肺結核患者597例，其中男383例，女214例，年齡13～94歲，平均年齡(49.62±21.78)歲。(2)非結核病患者(對照組)1046例，其中男673例，女373例，年齡15～96歲，平均年齡(56.78±22.81)歲。包括肺部感染445例，慢性阻塞性肺疾病70例，慢性咳嗽46例，非結核性胸腔積液46例，發熱40例，煤工塵肺22例，細菌性肺炎17例，支氣管哮喘14例，慢性支氣管炎11例，矽肺9例，支氣管擴張6例，其他疾病(包括肺癌、呼吸道出血、病毒性感冒等)320例。

3.診斷標準：(1)菌陽肺結核：涂片和(或)培養陽性且對硝基苯甲酸(PNB)試驗陰性和噻吩-2羧酸肼(TCH)試驗陽性。(2)菌陰肺結核：以中華醫學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》[2]為依據，3次痰涂片及1次痰培養均為陰性的肺結核，具體診斷標準為：①典型肺結核臨床癥狀和胸部X線表現；②抗結核藥物治療有效；③臨床可排除其他非結核性肺部疾??；④PPD(5 IU)皮膚試驗強陽性，血清抗結核抗體陽性；⑤痰結核分枝桿菌PCR+探針檢測呈陽性；⑥肺外組織病理證實為結核病變；⑦支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢出抗酸分枝桿菌；⑧支氣管或肺部組織病理證實結核病變。具備1～6條中的3項或7～8條中任何1項可確診。(3)非結核病患者：排除結核病診斷的呼吸系統疾病患者。

二、試劑及方法

1.試劑：結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒采用上海奧普生物醫藥有限公司生產的結核分枝桿菌抗體診斷試劑盒(膠體金法；TB-DOT)及新加坡MP生物醫學亞太私人有限公司生產的結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒(膠體金法；ASSURE TB)進行檢測。T-SPOT.TB試劑盒由英國牛津大學生產，上海復興醫藥股份有限公司提供。

2.TB-DOT檢測：采用純化的結核分枝桿菌特異性外膜抗原，利用斑點免疫膠體金滲濾技術檢測結核IgG抗體，嚴格按照該試劑盒說明書操作。方法如下：(1)在檢測板的反應孔中間，加入2滴封閉液，等待薄膜吸入；(2)取40 μl新鮮的血清標本，加入反應孔中間，等待薄膜吸入；(3)在反應孔中間，加入6滴洗滌液，等待薄膜吸入；(4)在反應孔中間，加入2滴金標液，等待薄膜吸入；(5)在反應孔中間，加入6滴洗滌液，等待薄膜吸入，目測判斷結果。

3.ASSURE TB檢測：采用ASSURE TB結核抗體金標試劑，嚴格按照該試劑盒說明書操作。步驟如下：(1)試劑盒及標本恢復至室溫；(2)從原包裝鋁箔袋中取出試劑盒，應在1 h內盡快使用；(3)試劑盒置于干凈平坦的桌面上，用一次性塑料吸管垂直滴加25 μl無氣泡的標本于試劑盒的加樣孔1內；(4)當樣品前沿剛剛越過粉紅色質控線時加入3滴緩沖液；(5)拉下分離片直到感覺有阻力；(6)加1滴緩沖液于孔1中，測試結果應在15 min時讀取。陽性：AB或AC二條紅色條帶出現或ABC三條紅色條帶出現。B線和C線位于測試區(T)內，A線位于質控區(C)。結果表明標本中含結核分枝桿菌抗體。

4.T-SPOT.TB檢測：嚴格按照使用說明操作六步法。首先是外周血單個核細胞分離制備，其次是單個核細胞洗滌和計數，然后是制備工作濃度細胞懸液，再將細胞懸液和抗原加入微孔培養板，置于37 ℃，于5% CO2培養箱中孵育過夜，洗滌微孔板并加入酶標抗體，再洗滌微孔板加入底物反應液，最后進行斑點計數。根據抗原A和(或)抗原B孔的反應判斷結果：陰性對照孔斑點數為0～5，陽性樣本應為：抗原A或抗原B斑點數-陰性對照孔斑點數≥6；當陰性對照孔斑點數≥6，陽性樣本應為：抗原A或抗原B斑點數≥2×陰性對照孔斑點數。

5.聯合檢測：961例結核病組患者中有574例、1046例對照組患者中有664例同時進行2種結核抗體(TB-DOT、ASSURE TB)和T-SPOT.TB檢測。(1)串聯試驗：形成8種不同的結果類型，即8種譜型；ASSURE TB、TB-DOT和T-SPOT.TB檢測的結果均為陽性視為陽性，任意一項結果為陰性(7種譜型)視為陰性。(2)并聯試驗：2種結核抗體(ASSURE TB、TB-DOT)和T-SPOT.TB的檢測結果，任意一項為陽性視為陽性；檢測結果均為陰性視為陰性。

三、統計學分析

使用SPSS 17.0軟件對各項資料進行統計分析，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、兩種結核抗體診斷結核病的結果

兩組患者兩種抗體檢測結果分布情況見表1。ASSURE TB和TB-DOT金標試劑檢測的敏感度分別為45.99%(442/961)、52.86%(508/961)，特異度分別為76.00%(795/1046)、74.95%(784/1046)，陽性預測值分別為63.78%(442/693)、65.97%(508/770)，陰性預測值分別為60.50%(795/1314)、63.38%(784/1237)，一致率分別為61.63%(1237/2007)、64.37%(1292/2007)。

ASSURE TB和TB-DOT試劑盒檢測菌陽肺結核患者的陽性率分別為62.09%(226/364)、64.84%(236/364)，明顯高于菌陰肺結核患者的36.18%(216/597)、45.56%(272/597)，差異均有統計學意義(χ2值分別為60.99、33.69，P值均<0.05)。

二、結核抗體檢測聯合T-SPOT.TB診斷結核病的結果

結核病組與對照組同時采用兩種結核抗體金標試劑與T-SPOT.TB聯合檢測的結果見表2、3。

兩組患者檢測兩種結核抗體金標試劑與T-SPOT.TB試劑盒，行串聯試驗時，如表2所示，當ASSURE TB、TB-DOT和T-SPOT.TB 三項結果均為陽性時，構成比為24.04%，即敏感度為24.04%(138/574)，特異度達到89.91%(597/664)；兩組之間當ASSURE TB、TB-DOT和T-SPOT.TB 三項結果均為陽性和均為陰性時，兩種譜型的構成比差異有統計學意義。

兩組患者檢測兩種結核抗體金標試劑與T-SPOT.TB試劑盒，行并聯試驗時，如表3所示，當ASSURE TB、TB-DOT和T-SPOT.TB 三項結果任意一項為陽性時，其敏感度高達89.55%(514/574)，但特異度僅為21.23%(141/664)。

表1 不同組別患者采用兩種結核抗體金標試劑的檢測結果

注“合計”指ASSURE TB與TB-DOT檢測結果任意一項為陽性

表2 兩種結核抗體與T-SPOT.TB試劑盒檢測不同譜型在結核病組與對照組中的構成情況

注結核病組中574例(包括菌陽肺結核患者189例，通過細菌學確診；菌陰肺結核患者385例，通過臨床進行診斷)同時進行了ASSURE TB、TB-DOT、T-SPOT.TB檢測；對照組中664例同時進行了ASSURE TB、TB-DOT、T-SPOT.TB檢測

表3 兩種結核抗體與T-SPOT.TB試劑盒單獨、串聯及并聯檢測結核病組與對照組患者的診斷價值

注結核病組中574例(包括菌陽肺結核患者189例，通過細菌學確診；菌陰肺結核患者385例，通過臨床進行診斷)同時進行了ASSURE TB、TB-DOT、T-SPOT.TB檢測；對照組中664例同時進行了ASSURE TB、TB-DOT、T-SPOT.TB檢測。敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%，特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%，陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%，陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

討 論

2017年6月30日，“全國結核病診療與防控暨第二屆中西醫結合治療基礎與臨床新進展研討會”在宜昌市召開，會議期間召開了“結核抗體檢測專家共識討論會”，血清結核抗體檢測的臨床輔助診斷價值得到與會專家的一致認可。但是目前國內結核抗體在生產和檢驗使用中存在亂象，促使大家重新去審視結核抗體在國內應用的現狀，思考其在臨床診斷中的影響因素和存在問題，以及怎樣使用結核抗體，筆者就這些問題也做了一些思考。

筆者認為，雖然目前應用血清學檢測方法來診斷活動性結核病和肺外結核有一定的局限性，但是血清學仍然是臨床實驗室診斷的重要補充。血清學檢測在提高試劑盒檢測結果穩定性的基礎上，還有提高其敏感度和特異度的必要，以及拓展更多的臨床意義。

結核抗體檢測試劑注冊申報需要三項重要的技術資料，為主要原材料研究資料、分析性能評估資料和臨床試驗資料[1]。但是，即使是有注冊證的試劑，試劑相同、分組相同，不同的研究獲得的敏感度差異也很大，對于臨床上不同的結核抗體檢測結果，差異就會更大，所以結核抗體應用的標準化需要走很長的路。本研究結果顯示，TB-DOT試劑盒對菌陽肺結核和菌陰肺結核患者檢測的敏感度分別為64.84%、45.56%，但同樣是采用TB-DOT 試劑盒，不同研究對菌陽肺結核和菌陰肺結核患者檢測的敏感度差異也很大，分別為97%和86.8%[3]、88.3%和73.5%[4]、81.9%和73.3%[5]、80.0%和52.5%[6]，以及66.7%和63.6%[7]。其中熊峻峰[4]報道的研究條件(時間跨度和例數)與本研究較為相似，但結果(分別為88.3%、64.84%和73.5%、45.56%)差異很大。出現較大的差異，一部分來源于試劑使用的關鍵性風險點，如楊蕾等[8]指出結核病診斷中酶聯免疫斑點試驗存在受試者的病原學狀態、抗結核藥物治療進程和是否使用免疫抑制劑等關鍵性風險點。此外，環境設施、儀器耗材和檢測方法涉及到試劑的儲存運輸、實驗操作和質量控制，也可能影響到酶聯免疫斑點試驗試劑的檢測結果。

要解決這個問題，筆者認為在實際工作中必須做好幾件事情。首先，應該做試劑盒的性能驗證，應該與原理相同質量公認的試劑盒做比對，還要做好室內質量控制。其次，需要撰寫操作手冊文件，培訓員工，做好記錄。再次，需要對工作環境、存放試劑冰箱溫度嚴加控制。就此建立起一套完整的質量體系，才能從根本上解決結核抗體在檢驗科使用的亂象，才能保證不同實驗室間結果的可比性。加強質量控制，不僅同一試劑盒在實驗室間的結果能具有可比性，不同的試劑盒結果也可有一定的可比性。如本研究的TB-DOT和ASSURE TB試劑盒的檢測結果，敏感度為52.86%、45.99%，特異度為74.95%、76.00%，具有可比性。

TB-DOT檢測主要針對外膜抗原，而ASSURE TB檢測主要針對38 kDa抗原(相對分子質量為38 000 的抗原，簡稱為“38 kDa抗原”)，而T-SPOT.TB試驗是針對早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP 10)。2種結核抗體檢測在菌陰肺結核和菌陽肺結核患者的檢測中差異有統計學意義，有利于結核病療效的監測。這與劉毅等[9]報道的38 kDa蛋白血清抗體檢測在診斷活動性肺結核上有較好的診斷和應用價值的結果一致。劉毅等[9]同時也指出3種蛋白(38 kDa、線粒體通透性轉換蛋白64、肝素結合血凝素蛋白)在結核感染和發病中具有不同的臨床應用和診斷價值，并聯分析會提高檢測的敏感度。同理，當2種結核分枝桿菌抗體與T-SPOT.TB聯合檢測時，可以提高結核病診斷檢出率。本研究顯示，3種檢測技術并聯應用時，檢測敏感度達到了89.55%，3種檢測技術串聯檢測時，檢測特異度達到了89.91%。此外，串聯檢測會形成多種不同的譜型，可以初步掌握結核病組與對照組之間的差異譜型，為今后將譜型用于結核病的輔助診斷提供研究基礎。

機體感染結核分枝桿菌后體液免疫被激活，產生相應的抗體，但由于結核分枝桿菌菌體結構復雜，抗原成分多種多樣，此外個體的免疫背景不同也會表現出不同的抗體譜[10]。結核抗體譜的意義會在將來開發出來。所以未來應研究多種抗原并聯檢測患者血清中的多個抗體的試劑盒，以提高檢測敏感度為目的，未來結核抗體檢測研究還應分析不同抗體譜在結核病患者不同階段的應用價值。

由于本研究資料有限，只是分析了結核病患者與非結核病患者結核抗體與T-SPOT.TB聯合檢測各種譜型組合后的結果。結核病患者與非結核病患者在兩種結核抗體和T-SPOT.TB試劑盒聯合檢測的各種譜型中，當3項結果均為陽性和均為陰性時兩種譜型的構成比差異有統計學意義，其他譜型的意義目前還不明確。分析譜型在臨床方面的應用由于缺乏資料，還有待于進一步研究。

筆者大膽預測，未來會建立更多標準的單獨的結核抗體檢測體系，通過研究它們組成的各種譜型在潛伏性結核感染與活動性結核病患者、初治結核病患者與復治結核病患者之間的差異，找到各自在治療監測中的作用，將能夠更好地為臨床服務。

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EvaluationoftwoserologicaltestsandT-SPOT.TBmethodfortuberculosisdiagnosis

LIUJia-wen,LYUHong-yan.

DepartmentofClinicalLabortory,BeijingGeriatricHospital,Beijing100095，China

LIUJia-wen,Email：no818@163.com

ObjectiveTo explore the value of tuberculosis antibody (TB-Ab) detection and T-SPOT.TB test in TB diagnosis.MethodsBetween January 1,2016 and April 12,2017 in Beijing Geriatric Hospital,961 TB patients (defined as TB group; including 364 smear positive pulmonary TB cases (bacteriologically diagnosed) and 597 smear negative pulmonary TB cases (clinically diagnosed)) and 1046 non-TB patients (defined as control group) were included in this study.All subjects conducted serological TB-Ab detection by using TB-DOT (Shanghai Upper Bio-Tech Pharma Co.,LTD) and ASSURE TB (MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd.in Singapore) kits; among them,574 patients in the TB group and 664 patients in the non-TB control group

both T-SPOT.TB test and TB-Ab detections using the two gold standard reagents.The sensitivity and specificity of those three kinds of laboratory detection techniques or joint detection (including tandem detection and parallel detection) were analyzed.ResultsThe sensitivity and specificity of TB-DOT test were 52.86% (508/961) and 74.95% (784/1046),and those of ASSURE TB test were 45.99% (442/961) and 76.00% (795/1046).The sensitivity of TB-DOT and ASSURE TB were 64.84% (236/364) and 62.09% (226/364) for smear positive pulmonary TB patients versus 45.56% (272/597) and 36.18% (216/597) for smear negative pulmonary TB patients,which indicated that the sensitivity of TB-DOT and ASSURE TB was higher for smear positive patients compared with smear negative ones; the differences were statistically significant (χ2=60.99 and 33.69,allP<0.05).Tandem detection of two TB-Ab detections and T-SPOT.TB showed a sensitivity of 24.04% (138/574) and a high specificity of 89.91% (597/664).The parallel detection had a specificity of 21.23% (141/664) and a high sensitivity of 89.55% (514/574).24.04% (138/574) patients in the TB group and 10.09% (67/664) patients in the non-TB control group reacted positively in all of the three tests including ASSURE TB,TB-DOT and T-SPOT.TB detection,while 10.45% (60/574) cases in the TB group and 21.23% (141/664) cases in the non-TB control group reacted negatively; the differences were statistically significant (χ2=43.37 and 26.32,allP<0.05).ConclusionTandem of two TB-Ab detections and T-SPOT.TB test can improve the specificity,whereas parallel detection can improve the sensitivity in TB diagnosis.All positive and all negative profile in all of the three detections has an auxiliary value in serological diagnosis of TB.

Tuberculosis; Antibodies; Interferon-gamma; Reagent kits,diagnostic; Diagnostic techniques and procedures; Data interpretation,statistical

10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.008

100095 北京老年醫院檢驗科

劉佳文，Email：no818@163.com

2017-08-11)

郭萌)