HPLC法測定藏藥榜嘎中槲皮素和山奈酚的含量

西藏自治區食品藥品檢驗所，西藏 拉薩 850000

HPLC法測定藏藥榜嘎中槲皮素和山奈酚的含量

蘭鈞阿萍

西藏自治區食品藥品檢驗所，西藏 拉薩 850000

目的建立藏藥榜嘎中槲皮素和山奈酚的HPLC含量測定方法。方法采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇- 0.4%磷酸(45∶55)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為370 nm，柱溫為35 ℃。結果槲皮素進樣量在0.0706～0.5651 μg范圍內線性關系良好(r=0.9999)，平均回收率為98.43%，山奈酚進樣量0.0641～0.5130 μg范圍內線性關系良好(r=0.9999)，平均回收率為97.07%。結論該方法經方法學驗證，可用于藏藥榜嘎的質量控制。

榜嘎；槲皮素；山奈酚；高效液相色譜法；含量測定

榜嘎是藏族習用藥材，為毛茛科植物烏頭屬植物船盔烏頭Aconitumnaviculare(Bruhl.) Stapf和甘青烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.) Stapf的干燥全草[1-2]，主產于西藏、青海和甘肅等藏區海拔4000～5100 m的高山上，具有清熱解毒、燥濕生肌、收口等功效，臨床常用于流行感冒導致的發熱，肺胃熱病及肝膽熱癥，血癥，瘡瘍，蛇蝎咬傷和黃水病[3]。目前收載的藏藥成方制劑中，41個處方含有榜嘎，約占藏藥成方制劑20%，如十三味榜嘎散、十三味紅花丸等。傳統藏醫理論指出，西藏主要用船盔烏頭入藥，其余青海、甘肅、云南等藏區都用甘青烏頭入藥，由于高原生態脆弱，資源萎縮[4]，研究收集到的基本上都是甘青烏頭，只有2批船盔烏頭是自己采集到的。目前藏藥成方制劑都用甘青烏頭地上部分用藥，主要成分是黃酮醇氧苷[5-6]，根據特征圖譜研究榜嘎中主要含槲皮素和山奈酚。筆者采用高效液相色譜法同時測定槲皮素和山奈酚的含量[7-9]，現報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測器；CTO-20A柱溫箱)。

1.2 材料 槲皮素對照品(批號：100081-200907，含量以96.5%計)、山奈酚對照品(批號：110861-201310，含量以93.2%計)購自中國食品藥品檢定研究院。提取用甲醇和鹽酸為分析純，流動相體系中所用磷酸為色譜純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

藥材主要是采購和野外采集，產地見表1，經西藏自治區食品藥品檢驗研究院次旦多吉鑒定為毛茛科植物烏頭屬植物船盔烏頭Aconitumnaviculare(Bruhl.) Stapf和甘青烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.) Stapf的地上部分。

表1 榜嘎樣品來源

2 方法和結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇-0.4%磷酸(45∶55)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：370 nm；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，槲皮素和山奈酚分離良好，并與其他成分能達到基線分離。理論板數按槲皮素板數為10 400，分離度大于1.2。色譜圖如圖1所示。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品18.30 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，作為槲皮素對照品溶液；精密稱取山奈酚對照品17.20 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，作為山奈酚對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸(4∶1)25 mL，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇-25%鹽酸(4∶1)補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取槲皮素對照品溶液(35.3190 μg/mL)和山奈酚對照品溶液(32.0608 μg/mL)2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件，測定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，槲皮素回歸方程為Y=3E+06X+35850 (r=0.9999)，表明槲皮素進樣量在0.0706～0.5651 μg與峰面積呈良好的線性關系。山奈酚回歸方程為Y=4E+06X+29580(r=0.9999)，表明山奈酚進樣量在0.0641～0.5130 μg與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 取同一混合對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，以峰面積考察精密度，槲皮素RSD為0.1%，山奈酚RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取本品粉末(編號9)1 g，共6份，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果槲皮素平均含量為0.13%，RSD為1.13%，山奈酚平均含量為0.08%，RSD為1.26%，結果表明重復性良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12 h，按“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，槲皮素峰面積平均值為2211604，RSD為0.71%，山柰素峰面積平均值為1346422，RSD為0.97%。結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗 取已知含量的同一批樣品(編號9)6份，每份0.5g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，再分別精密加入槲皮素和山奈酚對照品溶各1 mL，精密加入甲醇-25%鹽酸(4∶1)25 mL，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇-25%鹽酸(4∶1)補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按“2.1”項下的色譜條件測定，計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.9 不同品牌色譜柱考察 取樣品(編號9)，按擬定的含量測定方法，對同一編號樣品不同色譜柱進行測定。結果表明耐用性良好。見表4。

表4 耐用性考察

2.10 樣品的測定 每個樣品取2份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，用外標法計算出17批榜嘎含量。結果見表5。

表5 榜嘎中2種成分含量測定結果 (n=2)

3 討論

3.1 測定波長的選擇 經DAD二極管陣列檢測器在線檢測，槲皮素在350 nm處有最大吸收，山奈素在370 nm處有最大吸收，綜合考慮以370 nm作為檢測波長測定槲皮素和山奈素的含量。

3.2 流動相的選擇 分別考察了甲醇-0.4%磷酸不同比例的流動相系統進行等度和梯度洗脫，結果表明，用甲醇-0.4%磷酸進行等度洗脫為佳，各色譜峰保留時間適中，峰形和分離均較好，且時間短。

3.3 供試品溶液制備方法的確定 因槲皮素和山奈素屬于黃酮類成分，故參考《中國藥典》2015年版垂盆草和銀杏葉含量測定項下黃酮類成分的提取方式，分別對提取溶劑、提取方法以及提取時間進行了考察，篩選出合理的提取方法。最初只用甲醇提取，未加酸，黃酮類成分復雜峰分離差，不適合含量測定。最終考慮加酸，結果峰分離較好。在試驗過程中分別考察了以酸量(3∶1)、酸量(4∶1)、酸量(5∶1)作提取溶劑，供試品含量測定結果以酸量(4∶1)最佳，最終選取酸量(4∶1))為提取溶劑。又以酸量(4∶1)為提取溶劑，考察了加熱回流30 、60、90 min提取情況，結果表明，加熱回流60 min提取已經完全。故最終選擇酸量(4∶1)作為提取溶劑加熱回流1h作為前處理條件。

3.4 結果分析 由于榜嘎資源匱乏，尤其是船盔烏頭采集困難，本研究17批樣品歷時1年時間收集，基本涵蓋了整個藏區企業使用的榜嘎藥材。含量測定結果表明，所有樣品槲皮素含量均高于山奈酚，17批樣品的槲皮素和山奈素的總量在0.04%～0.39%，不同產地的榜嘎藥材含量差異明顯，表明雖然企業用的都是榜嘎，但主要還是甘青烏頭為主，且甘青烏頭也存在差異。槲皮素和山奈酚是榜嘎藥材中的有效成分，筆者采用高效液相色譜法測定槲皮素和山奈酚，操作簡單，重復性和耐用性良好，可作為控制榜嘎藥材質量的指標之一。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出社,2010.

[2] 羅達尚.新修晶珠本草[M].成都:四川科學科技出版社,2003.

[3] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：藏藥(第一冊)[M].北京：人民衛生出版社，1995.

[4] 劉志明.藏藥榜嘎榜那的資源調查和藥用合理性評價[D].北京:北京中醫藥大學,2013.

[5] 羅明.藏藥榜嘎化學成分和藥理作用的研究進展[J].中國實驗學,2012,18(12)：299.

[6] 李艷茸,李春,王智明，等.藏藥甘青烏頭化學成分研究(Ⅲ)[J].中國中藥雜志，2014,39(7)：1163-1167.

[7] 葉敏，閻玉凝，喬梁，等. 中藥菟絲子化學成分研究[J].中國中藥雜志，2002，27(2)：115-117.

[8] Bharat B. S. New flavonoid glycosides from Aconitum naviculare (Brühl) Stapf, a medicinal herb from the trans-Himalayan region of Nepal[J].Carbohydrate Research，2006(341)：2161-2165.

[9] Mariani C. Flavonoid characterization and in vitro antioxidant activity of Aconitum anthora L. (Ranunculaceae)[J]. Phytochemistry，2008,69(5):1220-1226.

DeterminationoftheContentofQuercitrinandKeampferolinTibetanHerbofBanggabyHPLC

LAN Jun A Ping

Tibet Institute for Food and Drug Control, Lhasa 850000, China

ObjectiveTo establish a HPLC determination method for quercitrin and keampferol in Tibetan herb of Bangga.MethodsThe chromatogram column was Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm), the mobile phase consisted of methanol-0.4% phosphoric acid (45∶55) at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 370nm and the column temperature was 35 ℃.ResultsThe calibration curve ofquercitrin was 0.0706～0.5651 μg (r=0.9999) and the average recovery rate was 98.43%. The calibration curve of keampferol also had a good linear relationship in the mass range of 0.0641～0.5130 μg (r=0.9999) and the average recovery rate was 97.07%.ConclusionThe method was validated and could be used for the quality control of Tibetan herb of Bangga.

Bangga; Quercitrin; Keampferol; HPLC; Content Determination

蘭均(1984-)，女，漢族，本科，主管藥師，研究方向為藥品檢驗和質量標準增修訂。E-mail:62379376@qq.com

R284.2

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1007-8517(2017)24-0014-04

2017-11-08 編輯：鄧佳麗)