屏邊三七總皂苷的含量測(cè)定研究

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1. 云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111

屏邊三七總皂苷的含量測(cè)定研究

李莉1劉勇2張美1*

1. 云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111

目的測(cè)定屏邊三七中總皂苷的含量。方法通過實(shí)驗(yàn)研究確定了屏邊三七總皂苷檢測(cè)時(shí)的顯色條件及檢測(cè)波長(zhǎng)。采用紫外-可見分光光度法測(cè)定屏邊三七中總皂苷的含量。結(jié)果屏邊三七中總皂苷在5 %香草醛-冰醋酸和73%的高氯酸溶液中，于65 ℃下加熱25 min顯色最優(yōu)，最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為543 nm；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收試驗(yàn)等RSD均小于2.5 %。結(jié)論屏邊三七中總皂苷平均含量為3.60 %。所建立的檢測(cè)方法可靠、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，其可用于屏邊三七中總皂苷的含量測(cè)定。

屏邊三七；齊墩果酸；總皂苷；紫外-可見分光光度法；含量測(cè)定

三七作為名貴藥材，其莖有止血療傷、散瘀鎮(zhèn)痛和滋補(bǔ)之效[1]，在民間還有“生打熟補(bǔ)”的功效，即直接使用生藥能治療跌打損傷，而其煮熟后的肉質(zhì)具有滋補(bǔ)之用。屏邊三七(PanaxstipuleanatusTsai et Feng)又稱土三七、香刺、白三七、竹節(jié)七等，產(chǎn)于云南東南部海撥約為1100 ～ 1700 m的熱帶雨林如屏邊、馬關(guān)、麻栗坡和河口一帶[2]。如圖1所示。鑒于目前對(duì)屏邊三七的整體研究較少，也尚未見到國(guó)內(nèi)(外)關(guān)于屏邊三七根莖中總皂苷含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道，筆者研究測(cè)定屏邊三七藥材中齊墩果酸型總皂苷類成分的含量，為進(jìn)一步研究屏邊三七根莖中皂苷類成分提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)；十萬(wàn)分之一電子天平(SHIMADZU)；SK3300LH超聲波清洗器；HB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；DHG智能恒溫干燥箱(上海景邁儀器設(shè)備有限公司)；DFY-C萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 試劑 齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：110709-201607，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；屏邊三七根莖采自云南省河口縣蓮花灘，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院李婭瓊教授鑒定為五加科人參屬植物屏邊三七PanaxstipuleanatusTsai et Feng，其根莖經(jīng)自然干燥后粉碎，樣品過四號(hào)篩。實(shí)驗(yàn)中甲醇、無(wú)水乙醇、香草醛、冰醋酸和高氯酸均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭凰疄槿ルx子重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取10.00 mg已干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品，用甲醇溶劑配制成100mL 0.1 mg/mL齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材粗粉0.5 g并將其置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶劑20 mL，隨后超聲提取30 min，過濾；該濾渣再用甲醇重復(fù)提取1次，合并兩次濾液，將其用甲醇定容至50 mL，搖勻后即得樣品總皂苷提取液。

2.3 總皂苷顯色方法和檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 鑒于總皂苷和齊墩果酸皂苷元與香草醛-高氯酸/硫酸體系反應(yīng)后產(chǎn)物在可見光區(qū)可獲得穩(wěn)定的特征吸收峰，參照文獻(xiàn)[3-7]，研究分別嘗試了香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸、香草醛(5%)-乙醇-硫酸和香草醛(5%)-冰醋酸-硫酸三種體系對(duì)屏邊三七中總皂苷顯色的影響研究試驗(yàn)。

2.3.1 香草醛-冰醋酸-高氯酸法 取2.1項(xiàng)下所得對(duì)照品溶液0.5 mL，將其置于具塞試管中揮干，隨后加入香草醛(5%)- 冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，將其搖勻備用。此混合液在60 ℃水浴中加熱20 min，隨后加入冷水終止反應(yīng)，再加入5 mL冰醋酸，混勻。實(shí)驗(yàn)中再以不加對(duì)照品的溶液作空白對(duì)照，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。所得光譜圖如圖2所示。

2.3.2 香草醛(5%)-乙醇-硫酸法 取對(duì)照品溶液0.5 mL，置于具塞試管中，揮干，加入0.2 mL香草醛(5%)-乙醇溶液以及60 % 的硫酸3 mL，隨后在60 ℃水浴中反應(yīng)20 min，立即用冷水終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中再以不加對(duì)照品的溶液作空白對(duì)照品，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。實(shí)驗(yàn)所得光譜圖見下圖3所示。

2.3.3 香草醛(5%)-冰醋酸-硫酸法 取對(duì)照品溶液0.5 mL，置于具塞試管中，揮干，隨后加入香草醛(5 %)-冰醋酸溶液0.2 mL和60 %硫酸3 mL。將此溶液在60 ℃水浴中加熱反應(yīng)20 min后取出，隨即用冷水終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中以不加對(duì)照品的溶液作空白對(duì)照品，在400 ～ 800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。所得紫外吸收光譜圖見圖4。

從圖2、圖3和圖4可看出，香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸法的靈敏度高、穩(wěn)定性好，故選此體系為屏邊三七中總皂苷顯色的試劑。從圖2可以看出，該顯色方法下的最大紫外吸收波長(zhǎng)為543 nm，故選擇543 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸顯色法中顯色劑用量的選擇 在顯色實(shí)驗(yàn)中，香草醛(5%)-冰醋酸溶液的用量和高氯酸的用量將直接影響生成有色物質(zhì)的多少，從而影響紫外吸收。

2.4.1 香草醛(5%)-冰醋酸溶液用量的選擇 取0.5 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液共5份，分別置于具塞試管中揮干，各加入香草醛(5%)-冰醋酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，隨后再各加入0.8 mL高氯酸。將此6份混合液置于60℃水浴中反應(yīng)20 min，隨即加入少量冷水終止反應(yīng)，10 min后再加5 mL冰醋酸，搖勻備用。將以上制備的溶液在543 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香草醛(5%)-冰醋酸溶液用量為0.3 mL時(shí)溶液吸收值最強(qiáng)，故為增強(qiáng)屏邊三七中總皂苷顯色的靈敏度，試驗(yàn)中選擇加入0.3 mL香草醛(5%)-冰醋酸溶液。

表1 5%香草醛-冰醋酸溶液用量結(jié)果

2.4.2 高氯酸用量的選擇 分別取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.5 mL各6份，將其置于具塞試管中揮干，分別加入香草醛(5%)-冰醋酸溶液0.3 mL，再各加入高氯酸0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，搖勻溶液，將其置于60 ℃水浴中反應(yīng) 20 min，隨后用冷水終止反應(yīng)，10 min后再各加 5 mL冰醋酸，搖勻備用。將所制備的溶液分別在543 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高氯酸用量為0.8 mL時(shí)，其紫外吸收值最大，故測(cè)定時(shí)以0.8 mL高氯酸用量為最佳。

表2 高氯酸用量結(jié)果

2.4.3 加熱溫度的選擇 在以上確定的最佳條件的基礎(chǔ)上，考察顯色時(shí)加熱溫度的影響，具體操作如下：分別取0.5 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液5份，置于具塞試管中，揮干，分別加入香草醛(5 %)-冰醋酸溶液0.3 mL和高氯酸0.8 mL，隨即分別置于50、55、60、65、70℃水浴中加熱20 min后取出，再分別加入少量冷水終止反應(yīng)，10 min后依次加入冰醋酸5 mL，搖勻備用。將所得溶液在543 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，總皂苷與顯色試劑在65 ℃反應(yīng)時(shí)，溶液的紫外吸收強(qiáng)度最大，故該加熱溫度最佳。

表3 加熱溫度的選擇

2.4.4 加熱時(shí)間的選擇 分別取0.5 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液5份，置于具塞試管中，揮干，分別加入香草醛(5%)-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻。隨后在65 ℃水浴中分別加熱10、15、20、25、30 min后取出，再加入少量冷水終止反應(yīng)，最后加入冰醋酸5 mL，搖勻備用。將所制備的溶液分別在543 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)加熱時(shí)間為25 min時(shí)最佳。

2.5 含量的測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于具塞試管中揮干，隨后加入香草醛(5 %)-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸0.8 mL，并在65 ℃水浴中分別加熱25 min后取出，用冷水終止反應(yīng)，隨后加入5 mL冰醋酸，搖勻備用。將顯色后的溶液在543 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收值，隨后以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.031X+0.0032，其相關(guān)系數(shù)r=0.9998，且齊墩果酸在3.278～19.672 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密量取同一對(duì)照品，按2.5.1項(xiàng)下顯色方法操作制備顯色溶液，重復(fù)測(cè)定6次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.33%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取藥材粗粉0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下操作方法制備供試品溶液，再按2.5.1項(xiàng)下的顯色方法顯色，隨后分別于0、10、20、30、40、50和60 min測(cè)定其吸光度，實(shí)驗(yàn)所得RSD為 0.16 %，表明方法顯色后的樣品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取0.5 g藥材粗粉6份，按“2.2”項(xiàng)下操作方法制備供試品溶液，再按2.5.1項(xiàng)下顯色方法顯色，并分別在543 nm下測(cè)定顯色后溶液的吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總皂苷含量平均值為：3.67%，且RSD為0.88%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的供試品溶液0.4 mL，隨后加入齊墩果酸對(duì)照品溶液1.0 mL，按2.5.1項(xiàng)下方法顯色操作并測(cè)定吸收度，再按公式1計(jì)算加樣回收率，所測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 樣品的含量測(cè)定 精密稱取藥材粗粉6批，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1項(xiàng)下所示顯色方法顯色，并在543 nm下測(cè)定顯色后溶液的吸光度，從而測(cè)定樣品含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中總皂苷的含量分別為：3.60%、3.67%、3.55%、3.54%、3.71%和3.60%，平均含量為3.60%，其RSD為1.85%。

3 結(jié)果與討論

3.1 總皂苷顯色方法 實(shí)驗(yàn)中分別采用香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸、香草醛(5%)-乙醇-硫酸和香草醛(5%)-冰醋酸-硫酸三種體系對(duì)藥材提取物進(jìn)行顯色，顯色后溶液的紫外分光光譜圖顯示同等條件下香草醛(5%)-冰醋酸-高氯酸體系的靈敏度高、穩(wěn)定性好，故選此體系為屏邊三七中總皂苷顯色的試劑。

3.2 顯色條件 在顯色實(shí)驗(yàn)中，顯色劑加入的量以及反應(yīng)的溫度和時(shí)間會(huì)直接影響顯色的效果，因此，實(shí)驗(yàn)中還分別探討了香草醛(5%)-冰醋酸溶液用量由0.1～0.5 mL，高氯酸用量由0.6～1.6 mL，加熱溫度由50～70 °C，加熱時(shí)間由10～30 min等單因素變化過程中吸光度的變化值。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各單因素下溶液的最大紫外吸收值對(duì)應(yīng)的條件分別為：0.3 mL香草醛(5 %)-冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸、反應(yīng)溫度65 ℃以及反應(yīng)時(shí)間為25 min。故最佳顯色條件為香草醛(5 %)-冰醋酸和73%高氯酸溶液，在65 ℃下反應(yīng)25 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為543 nm。

3.3 含量測(cè)定以及所建立方法的系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 為測(cè)定屏邊三七樣品中齊墩果烷型的總皂苷含量，實(shí)驗(yàn)中采用了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.031X+0.0032，其相關(guān)系數(shù)r=0.9998。同時(shí)，根據(jù)精密度(RSD為0.33%)、穩(wěn)定性(RSD為0.16%)、重復(fù)性(RSD為0.88%)和加樣回收率(平均加樣回收率為99.08%，RSD為2.11%)等數(shù)據(jù)，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、穩(wěn)定，且重現(xiàn)性好。在此條件下，6批樣品中總皂苷含量的平均含量為3.60%，其RSD為1.85%。

屏邊三七中主要藥理活性成分是齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，本研究創(chuàng)新性地采用紫外分光光度法測(cè)定屏邊三七總皂苷的含量。實(shí)驗(yàn)探討了目標(biāo)三萜皂苷所用的顯色劑種類、顯色條件以及最終檢測(cè)波長(zhǎng)等條件。同時(shí)，經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率等系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，證明該測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、可靠且重現(xiàn)性好。最后，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，測(cè)定了屏邊三七總皂苷的平均含量為3.60 %，其RSD為1.85 %。研究結(jié)果表明紫外分光光度法測(cè)定屏邊三七總皂苷含量的方法操作簡(jiǎn)便，其結(jié)果可靠、穩(wěn)定，且重現(xiàn)性好。該研究為屏邊三七的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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DeterminationofTotalSaponinsinPanaxstipuleanatusTsai

LI Li1LIU Yong2ZHANG Mei1*

1. College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500，China；2. Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111，China

ObjectiveTo study the content of total saponins forPanaxstipuleanatusTsai.MethodsThe chromogenic conditions and detection wavelength of the total saponins for Panax stipuleanatus were determined by the experimental study and the determination of it by UV Spectrophotometry.ResultsWhen thePanaxstipuleanatusTsai was reaction at 65 ℃ for 25 min in solution of 5% vanillinacetic acid and 73% perchloric acid, and detected at 543 nm was optimum. The method of determination was proved to be simple，precise and reproducible since theRSDfor precision, repeatability, stability and sample recovery rate was lower than 2.5%, respectively.ConclusionThe average detection content was 3.60% according to the method. The study showed that this method can be used for the quantitative determination of the total saponins inPanaxstipuleanatusTsai.

PanaxstipuleanatusTsai; Oleanolic Acid; Total Saponins; UV-Visible Spectrophotometry; Content Determination

云南衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(KY14)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21665030)，云南省教育廳科研項(xiàng)目(2015Z122)。

李莉(1968-)，女，漢族，本科，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)及中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: LiLi_0429@163.com

張美(1984-)，女，漢族，博士研究生，講師，研究方向?yàn)樗幬锓治觥-mail：meizhang213@163.com

R284.1

A

1007-8517(2017)24-0018-05

2017-11-17 編輯：鄧佳麗)