DBP和BPA對MCF-7細胞的聯合效應及機制

胥志祥,劉 君,羅 鬧,吳昕昊,慕凱琳,潘學軍 (昆明理工大學環境科學與工程學院,云南 昆明 650500)

塑料制品(如玩具制造、醫療器材和食品包裝等)廣泛應用于人類日常生活生產中,而鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)和雙酚 A(BPA)則常用于聚碳酸酯塑料制品的工業生產.鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)作為一種增塑劑,在醫療用品和化妝品中普遍存在,由于其潛在的危害已被美國、歐盟以及中國列入優先控制的污染物名單[1-2].DBP和BPA廣泛存在于水體、土壤及沉積物等環境介質中[1],其中DBP在我國長江、珠江等自然水體中普遍檢出,且其濃度高達 9.48～218.8μg/L[3].課題組前期研究也表明BPA是滇池流域環境介質中普遍存在的烷基酚類內分泌干擾物(EDCs)之一,其在滇池地表水、表層沉積物、環滇河流、污水處理廠進水和滇池特有魚類高背鯽魚中的平均濃度分別為 71.25～366.45ng/L、2.33～132.48ng/g dw、35.28～1080.97ng/L、458.58～1324.66ng/L 和 10.1～83.5ng/g dw[4].然而,傳統的生物處理并不能完全將其有效去除,并通過直接作用或生物富集進入生物體內,最終引起多種組織和器官的毒性反應[5-7].由于長期暴露于環境中,DBP和BPA在人體組織和體液中也被廣泛檢出,主要包括尿液、血液、母乳及孕期胎盤組織和羊水等,其濃度范圍為幾至幾十納摩爾[8-9].近期研究發現PAEs和BPA表現出類似的內分泌干擾效應和毒性效應,如肝臟毒性、生殖毒性、神經毒性及致癌性等[10-12].DBP和BPA作為兩種典型外源雌激素(XEs),其可通過基因組途徑和非基因組途徑,誘發多種癌癥的發生[13-14].然而,不同 XEs所產生影響的性質、程度和信號通路方式等都可能不同,因此關于DBP和BPA不同暴露濃度下的聯合效應有待開展進一步的研究.常用的毒性評價方法包括動物模型和體外模型兩種,相比于動物模型,體外研究中的細胞培養實驗具有高通量、低成本的優點,并可通過研究化合物誘導下細胞的增殖情況研究其雌激素效應[15].

基于此,本研究選取經典乳腺癌細胞系MCF-7為研究對象,探討DBP和BPA單一和聯合作用下的雌激素效應和毒性效應,并從細胞周期、細胞凋亡、活性氧自由基(ROS)產生以及雌激素受體(ER)表達等分子層面探討其可能的效應機制,以期為環境中兩種XEs復合污染下的潛在環境健康風險評估和預防提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器設備

實驗試劑：DBP、BPA 標準品(分析純,Sigma-Aldrich);胎牛血清(FBS)、含酚紅 RPMI 1640培養基、無酚紅RPMI 1640培養基、PBS

緩沖溶液(Gibco);去激素胎牛血清(CD-FBS,Gemini Bio-products);青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶細胞消化液、MTT細胞增殖及細胞毒性試劑盒、ROS試劑盒、細胞周期和細胞凋亡試劑盒(Beyotime).RNA 提取試劑盒(RNAiso Plus)、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser)和熒光染料試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ)均購于Takara公司.

儀器設備：細胞培養箱(Cell Culture, ESCO);生物安全柜(Airstream A2型II級, ESCO);倒置熒光顯微鏡(IX73, OLYMPUS);酶標儀(SpectraMax M5, Molecular Devices);微量紫外可見分光光度計(NanoDrop 1000, NanoDrop);流式細胞儀(Guava easyCyte 6HT-2L, Merck Millipore);實時熒光定量 PCR儀(StepOnePlus, Thermo Fisher Scientific).

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MCF-7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學和細胞生物學研究所,并使用含酚紅 RPMI 1640完全培養液(含10% FBS、1% 青霉素-鏈霉素),置于37℃、5%CO2培養箱中傳代培養.為了消除內源雌激素對細胞生長的影響,待細胞融合度＞70%,換為無酚紅RPMI 1640培養液(含10% CD-FBS、1% 青霉素-鏈霉素)去激素培養 48h后用于后續研究.實驗用細胞均處于對數生長期,且整個實驗過程中細胞代數＜20代[16].

1.2.2 溶液配制 分別稱取一定量的 DBP和BPA標準品并溶于DMSO中,配置成0.1mol/L儲備液于-20℃低溫、避光保存,臨用前使用無酚紅RPMI 1640培養液(含5% CD-FBS)稀釋至實驗所需濃度,并保證DMSO濃度小于0.1%[17].

1.2.3 細胞活力檢測 研究采用 MTT試劑盒測定不同濃度DBP和BPA,單一或聯合刺激不同時間的細胞活力.取對數生長期 MCF-7細胞,采用 0.25%胰酶消化液消化后,以 10000/孔的細胞密度接種到96孔細胞培養板中,并設置空白組、溶劑對照組和樣品處理組,每組設置5個復孔.細胞貼壁培養24h后,小心吸取上清液并使用PBS清洗孔板,于每孔分別加入 200μL含不同濃度DBP 和 BPA(10-9～10-4mol/L)的培養液;分別刺激24,48,72h后加入含MTT A液的細胞培養液并繼續培養4h;培養結束后,吸取孔內MTT A液,并加入150μL MTT B液,充分溶解后使用酶標儀測定570nm下的OD值,其可間接反映活細胞數量.在單一刺激的基礎上,選取優化后的細胞活力時間和物質濃度,開展其聯合效應研究.細胞活力(CA)= (OD處理組—OD空白)/(OD對照組—OD空白) × 100%[18].

1.2.4 活性氧自由基測定 取對數生長期的細胞,以 5×104/孔的密度接種至 24 孔培養板貼壁培養 24h后加藥(同 1.2.3)處理 48h,每組設置3個復孔,移除細胞培養液并加入按照1：1000用無血清培養液稀釋后的濃度為 10μmol/L的DCFH- DA 熒光探針,置于細胞培養箱內 37℃避光孵育 30min.用無血清細胞培養液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA 探針,在酶標儀下使用 488nm 波長激發,檢測525nm處發射的熒光強度,并根據熒光強度確定細胞內ROS水平.

1.2.5 細胞周期和凋亡測定 取對數生長期細胞,以3×105/孔的密度接種至6 孔培養板貼壁培養24h, 加藥(同1.2.3)處理48h,每組設置3個復孔,然后分別采用細胞周期(PI單染)和細胞凋亡(PI, Annexin V-FITC雙染)試劑盒,并按照試劑盒說明書操作,使用流式細胞儀測定細胞周期分布和細胞凋亡情況.其中細胞周期分為 Sub-G0、G0/G1、S和G2/M,細胞增殖指數(PI)= S+G2/M;細胞凋亡包括早期凋亡(Annexin V-FITC(+),PI(-))和晚期凋亡(Annexin V-FITC(+), PI(+)).

1.2.6 RT-QPCR測定細胞內受體表達 雌激素核受體(ERα和ERβ)和G蛋白偶聯雌激素受體(GPR30) mRNA轉錄水平采用RT-QPCR進行分析.細胞加藥(同 1.2.3)處理后,采用 RNA 提取試劑盒提取細胞RNA并測定其濃度;取1 μg RNA樣品,并使用反轉錄試劑盒,于冰上配置反轉錄試劑,混合均勻后進行反轉錄反應合成 cDNA;采用熒光染料試劑盒,使用 StepOnePlus熒光定量PCR進行mRNA的測定,每個樣本組設置3個平行樣.RT-QPCR 反應條件為：(1)預變性： 95℃,30s,1個循環;(2)PCR反應：95 ℃, 5s→60 ℃, 30s,40個循環 ;(3)溶 解 曲 線 ：95℃ ,5s→60℃ ,1min,1個 循環.mRNA 表達水平采用 R=2-ΔΔCt公式計算[19],其中ΔΔCt =(Ct, target—Ct, β-actin)處理組—(Ct,target—Ct, β-actin)對照組.目的基因(ERα、ERβ 和GPR30)和內參基因(β-actin)引物如表1所示.

表1 RT-QPCR引物系列Table 1 Primer series used in RT-QPCR

1.2.7 數據處理 實驗數據采用平均值±標準誤差表示,采用SPSS 18.0統計分析軟件進行單因素方差分析(ANOVA),采用 Tukey法進行多重比較,P＜0.05表示具有顯著性差異,用Origin 9.0繪圖.

2 結果與分析

2.1 細胞形態變化觀察

圖1 DBP和BPA暴露誘導MCF-7細胞形態變化(×100)Fig.1 Morphological changes of MCF-7cells treated with DBP and BPA

如圖1所示,在低濃度 DBP和 BPA刺激下,MCF-7細胞形態并未發生變化,但隨著刺激時間的增加,細胞密度也相應增大,間接反映低濃度 DBP和 BPA可促進細胞增殖.而在高濃度(10-4mol/L)刺激下細胞形態發生了相應的變化,主要表現為：細胞處理 24h后細胞未完全伸展開且細胞間隙增大、細胞出現皺縮,培養 72h后細胞貼壁率嚴重降低、部分細胞膜結構被破壞、細胞大量皺縮.

2.2 DBP和BPA對MCF-7細胞活力的影響

圖2 DBP(A)和BPA(B)單一暴露對MCF-7細胞活力的影響Fig.2 Individual effects of DBP (A) and BPA (B) on cell activity of MCF-7

DBP和BPA對MCF-7細胞活力的影響如圖2和圖3所示,DBP和BPA可引起MCF-7細胞不同程度的增殖(毒性)效應.對于單一暴露,如圖2所示,隨著DBP和BPA刺激濃度的增加,細胞活力呈現“倒 U”型,即隨濃度的增加,細胞活力先增后減,并分別在濃度為10-6,10-7mol/L時其細胞活力最大,隨后其促增殖效應降低,并均在 10-4mol/L時抑制細胞增殖.為此,分別選取 DBP(10-6,10-4mol/L)和BPA(10-7,10-4mol/L)開展后續實驗.

除此之外,細胞活力也呈現時間依賴性.總體上,隨著暴露時間的增加,溶劑對照組和加藥組的OD570均呈現逐漸增加的趨勢,DBP和BPA分別遵循72h＞48h＞24h和72h≈48h＞24h的規律.DBP和BPA作用于MCF-7細胞24h并未出現增殖效應;當作用 48h時除個別劑量外均表現為增殖效應,DBP和 BPA分別在濃度為 10-6mol/L和10-7mol/L時其增殖效應最強;隨著暴露時間的延長,其累積效應越來越明顯.相對而言,DBP的整體增殖效應較 BPA 強.綜合考慮,后續實驗選取48h為最優刺激時間.

圖3 DBP和BPA聯合暴露對MCF-7細胞活力的影響Fig.3 Combined effects of DBP and BPA on cell viability of MCF-7

DBP和BPA聯合暴露對MCF-7細胞的增殖效應如圖3所示.效應疊加法(ES)是最常用聯合效應評估模型,其多用于評估多種XEs聯合暴露下的綜合效應[20].效應疊加指數(ESI)為聯合暴露效應與單一暴露效應均值的比值,其中 ESI=1,ESI＞1和ESI＜1分別表示聯合效應為加和、協同和拮抗.通過計算可得：ESIBPA(-7)+DBP(-6)、ESIBPA(-7)+DBP(-4)、 ESIBPA(-4)+DBP(-6)、ESIBPA(-4)+DBP(-4)分別為 1.0279±0.0156、1.0140±0.0119、0.9340±0.0174、0.9312±0.0238,由此可推斷低濃度BPA聯合DBP暴露,其刺激作用表現為加和作用;高濃度BPA聯合DBP暴露,其刺激作用表現為拮抗作用.

2.3 DBP和BPA對MCF-7細胞ROS的影響

如圖4所示,藥物刺激48h后,對于單一暴露,低濃度DBP和BPA暴露抑制ROS產生但與對照組無顯著差異,而高濃度暴露則顯著誘導ROS的生成.對于聯合暴露,低濃度聯合暴露相對于低濃度單一暴露,ROS生成有一定增加,但差異性不顯著;低濃度+高濃度聯合暴露相對于低濃度單一暴露無顯著差異,而相對于高濃度單一暴露其ROS生成則受到明顯抑制;高濃度聯合暴露能顯著誘導ROS的生成,但相對于單一暴露其ROS生成有所降低,間接表明高濃度DBP和BPA聯合暴露表現為拮抗作用.

圖4 DBP和BPA暴露對MCF-7細胞ROS生成的影響Fig.4 ROS formation in MCF-7cells treated with DBP and BPA

2.4 DBP和BPA對MCF-7細胞周期阻滯的影響

圖5 DBP和BPA暴露對MCF-7細胞周期分布的影響Fig.5 Cell cycle distribution in MCF-7cells treated with DBP and BPA

如圖5所示,對于單一暴露,低濃度 DBP和BPA刺激下,MCF-7細胞S期和G2/M期細胞分布比例明顯高于對照組,表明低濃度暴露可促使細胞由G0/G1期向S期推進,促進細胞DNA的合成;高濃度DBP和BPA刺激時,細胞周期阻滯于G0/G1期,而G2/M期細胞比例低于對照組,從而抑制細胞 DNA的合成.對于聯合暴露,相比于單一暴露,低濃度聯合暴露 G2/M 期細胞比例顯著增高,而高濃度聯合暴露細胞周期被阻滯于G0/G1期,與單一暴露和對照組均具有顯著差異.細胞增殖指數結果再次表明,DBP和BPA聯合暴露在低濃度下對細胞周期調節表現為加和作用,而在高濃度下則表現為拮抗作用.

2.5 DBP和BPA對MCF-7細胞凋亡的影響

圖6 DBP和BPA暴露對MCF-7細胞凋亡的影響Fig.6 Cell apoptosis in MCF-7cells treated with DBP and BPA

如圖6所示,對于單一暴露,低濃度 DBP和BPA刺激下,凋亡細胞比例與對照組相比具有統計學差異性,表明其可抑制細胞凋亡;高濃度暴露則可誘導細胞凋亡,且主要以誘導細胞早期凋亡為主.對于聯合暴露,相比于單一暴露,低濃度聯合暴露也能抑制細胞早期凋亡并與對照組具有統計學差異,但與單一暴露相比差異性不顯著;低濃度+高濃度聯合暴露可誘導細胞凋亡并與對照組相比具有統計學差異,相對于單一高劑量暴露,其早期凋亡比例有所下降但差異性不顯著;高濃度聯合暴露也明顯誘導細胞凋亡,相對于單一高劑量暴露,其誘導凋亡的比例有所降低,表明高濃度DBP和BPA對細胞凋亡也表現為拮抗作用.然而,高濃度聯合暴露時細胞壞死也明顯增多,這與前文細胞形態觀察結果具有一致性.

2.6 DBP和 BPA對 MCF-7細胞雌激素受體mRNA轉錄的影響

如圖7所示,無論是單一暴露還是聯合暴露,低濃度 DBP和 BPA可誘導 ERα和 GPR30 mRNA 轉錄,而高濃度暴露則可抑制 ERα mRNA轉錄.然而,DBP和BPA對ERβ mRNA的轉錄無顯著差異性.DBP和 BPA低濃度聯合暴露誘導ERα和GPR30mRNA轉錄表現為加和作用,而高濃度聯合暴露抑制 ERα mRNA轉錄則表現為拮抗作用.

圖7 DBP和BPA暴露對MCF-7細胞ERα、ERβ和GPR30 mRNA轉錄的影響Fig.7 mRNA transcription levels of ERα, ERβ and GPR30 in MCF-7cells treated with DBP and BPA

3 討論

傳統毒理學研究認為,污染物達到一定暴露劑量即可對生物體產生毒性效應,而低于安全閾值則不具有相應的毒性;EDCs作為一類典型的污染物,其在低濃度下能產生內分泌干擾效應[21].大多數 EDCs具有雌激素活性,因此也被稱為XEs. XEs可通過ER信號通路發揮雌激素效應,而 MCF-7對雌激素活性物質較為敏感,為此MCF-7細胞增殖試驗模型常用于外源物質的雌激素活性評價[15].DBP和BPA作為2種典型的XEs,在塑料制品的生產和使用過程中被釋放到環境中,并在不同環境介質中遷移和轉化,最終可能通過生物途徑或非生物途徑進入生物體內,因此存在不可忽視的健康風險.本研究 MTT實驗結果發現DBP和BPA在低濃度下促進MCF-7細胞增殖,而在高濃度下則表現為抑制細胞增殖的毒性效應,并且隨濃度的升高,其增殖率或抑制率也相應的增加,總體呈現“倒U”型劑量-效應關系,這與其他研究結果類似[22-23].與對照組相比,生理濃度 BPA刺激下,MCF-7細胞的增殖無顯著性差異,其他研究也得出類似結果[24],但這與部分研究中生理濃度BPA刺激細胞增殖存在出入[25].本研究中BPA在濃度為10-7mol/L時增殖效應最強,而其他研究發現 BPA在濃度為10-5mol/L時增殖效應最強[22,26],這可能是細胞培養條件和時間不同,或細胞在長期培養過程中細胞內雌激素受體缺失引起的細胞本身差異所致.本研究中DBP在濃度為10-6mol/L時其促增殖效應最強并與 10-5mol/L下的細胞活力差不多,這與Kim等[27]研究發現,DBP在濃度為10-5mol/L能顯著促進細胞增殖具有相似性.

另外,細胞活力表現出時間依賴性.對于DBP,即無論是低濃度下的細胞增殖效應,或是高濃度下的細胞毒性效應,其效應均表現為72h＞48h＞24h. Chen 等[23]研究表明,在 DBP 刺激下,細胞增殖效應表現為 48h＞72h＞24h,這可能由于細胞培養方式差異性所致,即本研究在整個實驗研究過程中均使用含CD-FBS的培養基,為細胞生長提供了必須的營養元素,而 Chen等[23]的研究在加藥處理前對細胞進行了無血清饑餓處理.對于 BPA,其增殖效應表現為 72h≈48h＞24h,與DBP的刺激結果存在一定差異.

在單一細胞活力的基礎上,深入探討DBP和BPA復合污染下的聯合效應更具有指導意義.在不同環境體系中,2種XEs的濃度配比不同,為此研究分別選取了 2種濃度下的 DBP (10-6和10-4mol/L)和 BPA (10-7和 10-4mol/L),研究采用ESI法分析了DBP和BPA的聯合作用方式,結果表明低濃度聯合暴露下其刺激作用表現為加和作用,而高濃度聯合暴露下其抑制作用表現為拮抗作用;Christen等[17]以MDA-kb2細胞為研究模型,并指出DBP和BPA具有抗雄激素作用,其在低劑量時表現為拮抗效應,但在高劑量時卻表現為協同效應,產生這一不同結果的原因可能是細胞、組織差異性所致.

MTT細胞活力只能從宏觀層面描述外源暴露對 MCF-7細胞的增殖活性,而不能深層次闡述其(抗)增殖的根本原因.因此,本研究在細胞活力的基礎上,從ROS生成、細胞周期分布和細胞凋亡調節等分子層面探討其促進增殖/誘導凋亡的本質原因所在.ROS作為細胞內第二信使,可通過DNA損傷、癌基因及周期調節蛋白表達誘導等方式刺激/抑制細胞增殖[28].大量研究表明內源性雌激素或外源雌激素活性物質暴露可誘導 ROS生成,并最終調節細胞增殖/凋亡過程[29-30].本研究中,低濃度DBP和BPA可促進細胞增殖但其ROS生成無統計學差異性,而高濃度暴露則顯著誘導ROS生成并最終抑制細胞增殖,導致這種結果的原因可能是高濃度暴露產生更多的ROS,可能引起DNA損傷或誘導細胞凋亡/壞死,從而產生增殖毒性[30].另外,XEs還可通過改變周期和凋亡相關基因(如CDKs、Cyclin D1、Bcl-2、Bax等)轉錄調節細胞增殖.Lee等[26]研究表明BPA可誘導Cyclin D1表達而抑制P21表達,促進細胞周期由G0/G1期向S期轉化,最終誘導MCF-7細胞增殖.本研究中,低濃度DBP和BPA暴露下,細胞周期由G0/G1期向S期和G2/M期推進,從而誘導細胞增殖,高濃度暴露下細胞周期則被阻滯于G0/G1期,這和Lee等的研究結果有相似性.除此之外,Kim 等[27]研究發現 DBP可顯著促進 MCF-7增殖,并且能通過增加胞內Bcl-2/Bax比例來抑制TAM誘導的凋亡.本研究中,低濃度DBP和BPA刺激下,凋亡細胞相對于對照組有所降低;高濃度暴露則可誘導細胞凋亡,且以誘導細胞早期凋亡為主.

由于BPA在化學結構上與內源雌激素雌二醇(E2)類似,故可干擾多重內分泌相關途徑,誘導各種疾病的發生和發展[11].Singh等[10]研究發現PAEs和BPA可同時與影響體內89種基因/蛋白結合,誘導相關生理效應,其中就包括了兩種經典核雌激素受體ERα和ERβ. ERα作為一種轉錄激活因子,可通過調節胞內細胞周期因子或其他生長因子影響細胞增殖,在乳腺癌的發生、發展中起著重要作用[26,31].不同類型的XEs與ER的親和力具有很大差異,且 ERα的促增殖效應可被ERβ拮抗,最終調節細胞的增殖效應[14].BPA 和DBP作為ERα/β的激動劑,其可通過與受體結合發揮雌激素效應,但兩者的活性 BPA＞DBP[9].本研究RT-QRCR結果發現高濃度DBP和BPA均可抑制ERα mRNA水平的轉錄,而低濃度暴露則可促進 ERα mRNA 轉錄;然而,DBP和 BPA 對ERβ mRNA轉錄無顯著影響.同時,低濃度XEs能通過GPR30激活非基因組途徑,誘導基因表達和細胞增殖[32].本研究也指出低濃度 DBP和 BPA可誘導GPR30mRNA的轉錄.Lillo等[24]研究也表明,盡管生理濃度下(10-8mol/L)的BPA不能明顯誘導MCF-7細胞增殖和雌激素效應基因的表達,但其可通過膜受體信號通路直接調節 SOX2轉錄活性以增強腫瘤干細胞樣細胞活性,從而維持癌癥的發展.Chen等[23]研究發現低濃度 DBP(10-8mol/L)可顯著誘導 p-ERα的表達而降低ERβ的表達,最終促進 MCF-7細胞的增殖.Song等[33]表明10-8mol/L濃度的BPA可通過ERK1/2/ERRγ通路誘導MCF-7細胞增殖.Lei等[30]研究指出低劑量BPA衍生物硫代二苯酚(TDP)通過ERα和 GPR30信號通路之間的串擾作用增加胞內ROS和Ca2+水平,激活PI3K/AKT和ERK信號通路,最終誘導MCF-7細胞增殖.為此,關于經典雌激素核受體和膜受體的交互作用在 XEs誘導細胞雌激素效應方面有待進一步研究.

本研究采用體外模型研究了 DBP和 BPA的聯合效應,這為開展多種 XEs在不同濃度聯合暴露產生的效應研究提供了指導.然而,環境介質中同時存在多種酞酸酯類和烷基酚類XEs,其可能通過不同的作用模式(相加、協同和拮抗)發揮相應的生物效應.此外,XEs在生命活動代謝過程中,會產生各種不同活性的代謝中間產物,這些代謝產物的生物效應也有待開展進一步研究,然而體外研究模型則很難模擬 XEs在生物體內的這一復雜生物效應.為此,今后的研究應將體外模型和體內實驗相結合,開展多種XEs的綜合效應研究,以便更好地為環境生態風險評估和預防提供指導.

4 結論

4.1 對于單一暴露,低濃度DBP和BPA可促進MCF-7細胞增殖,而高濃度DBP和BPA則誘導細胞凋亡.

4.2 對于聯合暴露,DBP和BPA低濃度下其聯合作用模式表現為加和作用,而在高濃度下表現為拮抗作用.

4.3 低濃度DBP和BPA單一或聯合暴露促進細胞增殖,其與推進細胞周期從G0/G1期向S期、G2/M期轉化,以及誘導ERα和GPR30表達相關.

4.4 高濃度DBP和BPA單一或聯合暴露可通過ROS增加、G0/G1期阻滯、細胞早期凋亡增加和ERα mRNA轉錄抑制等方式誘導細胞凋亡.

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