棗實蠅mtDNA COI基因片段克隆技術研究

程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉，朱萬友

(1.新疆農業大學林學與園藝學院，新疆 烏魯木齊 830052;2.昌吉州林業有害生物防治檢疫局，新疆 昌吉 831100；3.新疆出入境檢驗檢疫局技術中心,新疆 烏魯木齊 830083)

棗實蠅(CarpomyavesuvianaCosta)是全國林業檢疫性有害生物，是一種十分危險的新入侵的害蟲。2007年，首次在新疆吐魯番地區發現的重大檢疫性害蟲，系在新疆乃至全國棗產業上有著重要經濟意義的害蟲。在2007年5月29日發布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中把棗實蠅列為我國禁止進境的檢疫性入侵害蟲(中華人民共和國農業部公告，2007)[1-4]。棗實蠅屬雙翅目(Diptera)實蠅科(Tephritidae)實蠅亞科(Trypetinae)實蠅族(Trypetini)咔實蠅屬(CarpomyaCosta)。隨著中國經濟的高速發展，國內地區間和國際的商業貿易與人員往來日漸頻繁，造成棗實蠅的擴散概率越來越高。然而棗實蠅一旦入侵新的區域，往往會給入侵地的棗產業帶來嚴重的后果，甚至是毀滅性的打擊。因此，在棗產業安全與植物檢疫中棗實蠅的檢疫鑒定愈來愈重要[5,6]。

本研究首次利用DNA克隆技術，將棗實蠅mtDNA COI基因以菌液形式長期保存，當需要時可以取出培養提取質粒，解決了在口岸實蠅鑒定中國外獲取標本困難，或缺乏陽性對照的難題，為棗實蠅快速鑒定提供了材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棗實蠅蛹標本分別采自4個地區：吐魯番市、KSS、HSX和HMS，其采集地，個體數量及采集時間見表1。

表1 不同棗實蠅種群的標本采集地點、 個體數量以及采集時間

1.2 試驗方法

1.2.1 目標片段常規PCR擴增 棗實蠅mtDNA COI基因目標片段用引物Uea7和Uea10進行PCR擴增獲得，PCR反應體系：PCR擴增在定量梯度PCR儀上進行，反應體系： 10×Buffer2.5 μl，Mg2+2 μl，dNTP 2.5 μl，上下游引物各0.2 μl，1 UTaq酶(Takara)0.2 μl，模板DNA2.5 μl，加水至總體積25 μl。

PCR擴增條件：94 ℃/5 min，95 ℃/40 sec，48 ℃/30 sec，72 ℃/1 min，30 個循環，最后72 ℃延伸7 min。取PCR產物5 μl在含溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠上電泳30 min(90 V)，在數字圖像分析儀上檢測結果[6-8]。

1.2.2 PCR產物純化 將50μl左右的DNA樣品用含溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠上電泳30 min(90V)電泳分離，電泳緩沖體系為TBE?；厥誅NA(片段大約為700 bp)；采用寶生物工程(大連)有限公司生產的Takara Agarose Gel DNA Purfication Kit Ver.2.0 code DV805A純化目的條帶?；厥誅NA溶于25 μlElution Buffer中。

1.2.3 載體連接 將純化的PCR產物與pGM-T 載體 (大連寶生物公司)連接，操作按說明書進行，其中目的PCR片段7 μl， pGM-T 載體1 μl，10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl， T4 DNA Ligase (3 U/μl) 1 μl ，16 ℃過夜連接。

1.2.4 轉化 將5 μl連接液加入到50 μl新鮮制備的感受態細胞進行轉化；將細菌涂布在90 mm平板上，在制平板之前1 LLB培養基中加100 μlIPTG(50 mg·mL-1)和200 μl 20 mg·mL-1X -gal，細菌的用量依連接的效率及感受態細胞的感受率而進行適當的調整；平板在37℃下正向放置半小時以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。

1.3 檢測

1.3.1 常規檢測 重組克隆篩選一藍/白斑篩選，當外源DNA片段插入到pGM-T中后，由于外源DNA的核酸序列在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產物β一半乳糖苷酶ɑ片段的活性，因此重組克隆X-gal/IPTG平板上呈現為白色，而非重組克隆呈藍色[7]。

從平板中挑4個白斑克隆，置于4 mL LB-AMP培養基中，37 ℃，150 rpm過夜培養。采用寶生物工程(大連)有限公司生產的TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0抽提質粒，用Elution Buffer中溶解DNA， PCR法進行陽性克隆的篩選。采用的引物用UEA7和UEA10， PCR產物約700 bp。與克隆前PCR產物的大小一致，確定為陽性克隆。

1.3.2 酶切反應 在10 μL 反應體系中加入5 μL 質粒， 酶ECORI 1 μL， 10×buffer1 μL ， 最后加ddH2O至10 μL ，將上述混合液置37 ℃水浴4 h。

1.3.3 快速檢測 挑取白色菌落直接進行PCR檢測。

1.3.4 測序鑒定 使用常規檢測或快速方法進行初步的鑒定后進行序列的測定。

2 結果與分析

2.1 棗實蠅mtDNA COI基因片段克隆

本研究對四個地區棗實蠅的線粒體DNA細胞色素氧化酶I(COI)從M7至COOH之間約700 bp片段部分序列進行克隆，分別獲得克隆片段的菌液和質粒，菌液和質粒均保存于-20 ℃。

2.2 DNA克隆片段常規PCR檢測

用四個地區棗實蠅的DNA克隆片段的質粒直接作為模板，用引物Uea7和Uea10進行常規PCR檢測，以檢查克隆片段的大小，檢測結果如圖所示：可以看出500～750 bp之間大約700 bp目標片段的位置有一條擴增帶，亮度差異表示模板濃度的差異。DNA確切濃度和純度通過核酸蛋白檢測儀來測定。見圖1。

M: DL2000 DNA Marker; 1: HSX棗實蠅，2: HMS棗實蠅, 3：吐魯番市棗實蠅，4：KSS棗實蠅圖1 Uea7/ Uea10 引物 PCR 模板 DNA 質量電泳圖

2.3 酶切反應

用酶ECORI進行酶切反應，取酶切產物5 μl在含溴化乙啶的1.5%瓊脂凝膠上電泳30 min(90 V)，結果如圖2所示：

M: DL2000 DNA Marker; 1: HSX棗實蠅，2: HMS棗實蠅, 3：吐魯番市棗實蠅，4：KSS棗實蠅圖2 酶切電泳圖

3 討論

在棗實蠅快速鑒定上棗實蠅克隆片段具有很大的應用價值，在對未知的實蠅標本任何蟲態(無論是成蟲還是卵、幼蟲、蛹)在進行快速鑒定時，陽性對照可用棗實蠅的COI基因克隆質粒，而含棗實蠅mtDNA COI基因的菌液可以長期保存，當需要時可以取出培養提取質粒。這樣就解決了在口岸實蠅鑒定中國外獲取標本困難、或是缺乏陽性對照的難題，同時也為能夠進行大規模的SYBR Green PCR實時熒光檢測提供了充足的實驗材料[6-9]。

[1] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.棗實蠅四個地理種群的線粒體Cytb基因序列分析[J].林業科學,2014,50(3):144-150

[2] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉，等.棗實蠅特異引物PCR鑒定技術[J].林業科學,2013,49(11):98-102

[3] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.棗實蠅及相關5種檢疫性實蠅PCR-RFLP快速鑒定技術[J].南京林業大學,2014,38(1):183-185

[4] 程曉甜,阿地力·沙塔爾,張偉,等.SYBR Green實時熒光PCR快速鑒定棗實蠅技術[J].林業科學,2014,50(4):60-65

[5] 阿地力·沙塔爾,張偉,程曉甜,等.棗實蠅不同地理種群親緣關系研究[J].林業科學，2012,48(6):136-140

[6] 余道堅.檢疫性實蠅分子生物學快速鑒定技術的研究[D].北京:中國科學院研究生院(上海生命科學研究院),2005

[7] 申建梅,胡黎明,賓淑英,等.瓜實蠅嗅覺受體基因的克隆及表達譜分析[J].昆蟲學報,2011,54(3):265-271

[8] 申建梅,胡黎明,賓淑英,等.瓜實蠅普通氣味結合蛋白基因的克隆及原核表達[J].華中農業大學學報,2011,30(4):455-460

[9] Jamnonglik W,Baimai V，Kittayapong P. Molecular evolut -ion of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based on the cytochrome oxidase I gene[J].Genetica,2003,119(1):19-25