溫度對旱柳葉黃酮提取率及抗氧化活性的影響

王妮++閆唯++李佳++趙二勞

摘 要：為了研究溫度對旱柳葉中黃酮提取率及抗氧化活性的影響，試驗采用超聲輔助提取旱柳葉中黃酮，測定了不同溫度下旱柳葉黃酮的提取率及對DPPH·和·OH的清除率。結果表明：提取溫度對旱柳葉中黃酮提取率有較大影響，不同溫度下，旱柳葉黃酮提取率的大小順序為：60℃>50℃>70℃>40℃>30℃。旱柳葉中黃酮的最佳提取溫度為60℃，提取率為2.51%。提取溫度對旱柳葉黃酮抗氧化活性基本無影響。

關鍵詞：旱柳葉；溫度；黃酮；提取率；抗氧化性

中圖分類號：TS202.3 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20171232002

旱柳（Salix matsudana Koidz）為楊柳科柳屬落葉喬木，在我國各地特別是北方地區充當園林綠化和植樹造林的先鋒樹種，栽種頗多，分布廣泛，資源很是豐富。旱柳葉為旱柳樹的葉子是我國常用中藥，藥用歷史悠久。《本草綱目》中記載，柳為本經下品，其性苦寒，無毒，可治風水黃疸、瘡癰腫毒、炎熱淋疾等癥[1]。現代科學研究表明[2]，旱柳葉中含有黃酮類成分，具有諸多藥理功能活性，如延緩衰老、調節免疫、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂等，在大健康時代對促進人體健康能發揮積極作用。因此，旱柳葉中黃酮的研究應用，日益引起人們的興趣。張晶等[3]對旱柳葉化學成分進行了分離鑒定和藥理活性測定，從中分離出3種黃酮單體化合物，認為這些化合物對血栓的形成和動脈硬化有防治作用；劉暢等[4]研究認為旱柳葉黃酮具有較強的抗氧化活性；王立娟等[5]研究了旱柳葉中黃酮的超聲波輔助提取工藝，通過正交試驗優化確定了最佳提取工藝條件。但這些研究均未涉及提取溫度對黃酮提取率和抗氧化性的影響。因此，為進一步深入研究開發應用旱柳葉黃酮，提高旱柳葉的綜合應用價值，本試驗采用超聲波輔助提取旱柳葉黃酮，研究不同溫度對黃酮提取率及抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

旱柳葉2016年10月采集于忻州師范學院主校區，自來水沖洗干凈，在恒溫干燥箱中50℃下烘干，藥材粉碎機粉碎后，過40目篩，裝瓶保存待用。

1，1-二苯肼-2-苦肼基（DPPH·），（日本東京化成工業株式會社）；蘆丁標準對照品，（北京化學試劑公司）；其余試劑都為分析純，購自天津市風帆化學試劑有限公司；試驗用水為二次去離子水，由化學系實驗中心提供。

1.2 試驗主要儀器

高功率數控超聲波清洗器（KQ-400KD型）；紫外可見分光光度計（SP-723型）；水浴恒溫振蕩器（THZ-82型）；電子分析天平（AL204型）；循環水式真空泵（SHZ-D（Ш）型）；電熱鼓風干燥箱（DGF20022型）。

2 試驗方法

2.1 旱柳葉預處理

將粉碎過40目篩的旱柳葉粉中按1：10的比例加入石油醚脫脂24h后，抽濾，濾渣置50℃恒溫干燥箱中烘干，即為旱柳葉樣品，存放待用。

2.2 旱柳葉黃酮提取工藝流程

以體積分數50%的乙醇溶液為提取劑，在料液比、超聲功率和時間（料液比1：55、超聲功率400W、時間60min）相同的條件下，選取30℃、40℃、50℃、60℃和70℃5個不同的溫度，進行旱柳葉中黃酮的超聲波輔助提取[4]。

黃酮提取工藝流程：經預處理旱柳葉粉→超聲輔助提取→抽濾→定容→黃酮提取液。

2.3 旱柳葉黃酮提取率的測定

本試驗以蘆丁作標準對照品，參考文獻[4]采用硝酸鋁比色法測定旱柳葉中黃酮含量，并計算黃酮提取率。

2.3.1 蘆丁標準工作曲線的制備

參考文獻[4，6]方法稍作改動制備蘆丁標準曲線。準確吸取濃度為0.5mg/mL的蘆丁標準對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分別置于6支25mL比色管中，然后都加入質量分數5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，充分搖勻后，每支比色管中都加入質量分數10%的硝酸鋁溶液1.0mL，再充分搖勻，再于每支比色管中都加入質量分數4%的氫氧化鈉溶液10.0mL，最后用體積分數50%的乙醇溶液定容至25mL，搖勻后靜置反應15min，以2次去離子水為空白對照，在510nm最大波長下用分光光度計分別測定其吸光度。然后，以蘆丁標準品質量濃度（mg/mL）為橫坐標，所測吸光度值為縱坐標，制備蘆丁吸光度（A） ～質量濃度（c）標準工作曲線，由蘆丁標準工作曲線求得回歸方程為：

A = 11.723c-0.0055，相關系數R2 = 0.9999。

2.3.2 旱柳葉黃酮提取率的測定

吸取不同溫度下黃酮提取液2.0mL，按2.3.1中方法測定其黃酮含量，根據公式：黃酮提取率 （%） =（提取液中黃酮質量（mg） / 旱柳葉質量（mg））×100，計算旱柳葉黃酮提取率。

2.4 旱柳葉中黃酮抗氧化性測定

一般采用自由基清除法評價物質抗氧化性，本試驗采用DPPH·和·OH清除法來評價旱柳葉黃酮的抗氧化性。

2.4.1 旱柳葉黃酮對DPPH·的清除率

試驗參考文獻[7，8]的方法稍作改動，進行對DPPH·清除率的測定。準確移取質量濃度0.20mg/mL的 DPPH·溶液3.0mL，置于10mL比色管中，再加入定量的旱柳葉黃酮提取液，然后用體積分數50%乙醇溶液定容至10mL，搖勻，靜置于室內避光處，待反應30min后，在517nm最大波長下，測定該溶液體系的吸光度。測得：不加旱柳葉黃酮提取液僅DPPH·溶液體系的吸光度為A0；不加DPPH·溶液僅旱柳葉黃酮提取液體系的吸光度為Aj；旱柳葉黃酮提取液+DPPH·溶液體系的吸光度為Ai。不同溫度提取的旱柳葉黃酮溶液都做3次平行試驗，然后根據公式：清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0]×100，計算旱柳葉黃酮對DPPH·的清除率。endprint

2.4.2 旱柳葉黃酮對·OH的清除率

試驗參考文獻[8，9]方法并作一定改動后，進行對·OH清除率測定。準確移取質量濃度0.03mol/L硫酸亞鐵銨溶液1.0mL，置于10mL比色管中，再加入質量濃度0.03mol/L水楊酸溶液1.0mL，然后加入質量分數0.3%過氧化氫溶液1.0mL，用2次去離子水定容至10mL，搖勻，置于40℃恒溫水浴中反應30min，取出冷卻至室溫后，用分光光度計在510nm最大波長下，測得該溶液體系的吸光度為A0；測得加入一定量旱柳葉黃酮提取液后上述溶液體系的吸光度為Ai。。不同溫度提取的旱柳葉黃酮溶液都做3次平行試驗，然后根據公式：清除率（%）= [（A0-Ai）/A0]×100，計算旱柳葉黃酮對·OH的清除率。

3 結果與分析

3.1 溫度對旱柳葉黃酮提取率的影響

不同溫度下旱柳葉黃酮提取率測定結果見圖1。

由圖1可見，不同溫度下，旱柳葉中黃酮的超聲波輔助提取率不同。在不同溫度下，旱柳葉黃酮提取率的大小順序為：60℃>50℃>70℃>40℃>30℃，溫度60℃時旱柳葉中黃酮提取率最高，可達2.51%，為旱柳葉黃酮超聲輔助提取的最佳溫度。計算比較不同溫度時黃酮提取率的差異性，可知，60℃與70℃相比差異不顯著（P>0.05）；與50℃相比差異顯著（P<0.05）；與40℃或30℃相比差異極顯著（P<0.01）。這與陳建福等[10]研究白蘭葉中黃酮提取和羅磊等[11]研究金銀花葉黃酮提取所得結論一致。在30～70℃的試驗溫度范圍內，隨著提取溫度的升高，旱柳葉黃酮提取率呈先升高后下降，這是因為溫度升高，加快了分子運動速率，提高了黃酮的溶解度，提取率增加。但當溫度繼續升高，溫度過高影響黃酮的熱穩定性，黃酮容易在過高的溫度下發生氧化或降解，導致提取率下降[10-12]。得出各種天然產物中黃酮類活性成分均有一最適溶出溫度，在進行提取研究時，應充分考慮提取溫度的選擇。

3.2 旱柳葉黃酮抗氧化活性測定

3.2.1 對DPPH·清除率

按試驗方法，測定質量濃度30μg/mL黃酮提取液對DPPH·清除率，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮在濃度相同時、對DPPH·清除率的大小順序為：60℃>50℃>40℃>30℃>70℃。60℃提取的旱柳葉黃酮對DPPH·清除率最高可達83.64%。相同濃度時，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮對DPPH·清除率的差異性不大，基本在同一水平。表明提取溫度對旱柳葉中提取的黃酮種類及其抗氧化活性基本無影響。

3.2.2 對·OH清除率

按試驗方法，測定質量濃度為100μg/mL的黃酮提取液對·OH清除率，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮在濃度相同時對·OH清除率的大小順序為：50℃>60℃>40℃>30℃>70℃。50℃提取的旱柳葉黃酮對·OH的清除率最高可達57.23%。在相同濃度時，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮對·OH清除率的差異性不大。也表明提取溫度對旱柳葉中提取的黃酮種類及其抗氧化活性基本無影響。

4 結論

本試驗結果表明，提取溫度對旱柳葉中黃酮提取率有較大影響，旱柳葉中黃酮超聲輔助提取最佳溫度為60℃，該溫度下，旱柳葉黃酮提取率為2.51%。試驗也表明，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮對DPPH·清除率的差異性不大，對·OH清除率的差異性也不大，說明提取溫度對旱柳葉中黃酮提取的種類及其抗氧化活性基本無影響。

參考文獻

[1]鄭毅男，徐寶軍，張晶，等.旱柳葉活性成分研究[J].藥學實踐雜志，2000，18（5）：280-283.

[2]韓立芹，姜盼，金沙，等.旱柳葉中三種黃酮類成分以水楊苷含量的高效液相色譜法測定[J].時珍國醫國藥，2012，23（2）：396-398.

[3]張晶，鄭毅男，韓立坤.旱柳葉抗血栓、抗動脈硬化活性成分的研究[J].中藥材，1999，22（3）：131-133.

[4]劉暢，郭建紅，趙鑫鵬，等.旱柳葉中黃酮及其抗氧化活性的測定[J].山東化工，2016，45（16）：67-68，70.

[5]王立娟，李堅，谷肄靜.超聲波輔助提取旱柳樹葉中的總黃酮[J].林產化學與工業，2007，27（S1）：133-136.

[6]林曉，馬艷蕾，張萊娣，等.星點設計法優化黃芪總黃酮提取工藝及抗氧化活性測定的研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（15）：204-207，302.

[7]麻文勝，黎國慶，鐘華鋒，等.油梨仁提取物的體外抗氧化活性研究[J].食品工業，2017，38（2）：96-99.

[8]石秀花.超聲波提取野玫瑰色素及體外抗氧化性分析 [J].食品研究與開發，2017，38（9）：90-94.

[9]張晶，楊曉杰，孫百良，等.溫度對桔梗多糖提取率及抗氧化的影響 [J].黑龍江畜牧獸醫， 2016（18）：161-163.

[10]陳建福，林洵，林萍萍，等.響應面法優化超聲輔助提取白蘭葉總黃酮工藝[J].食品工業科技，2016，37（15）：238-242.

[11]羅磊，張冰潔，朱文學，等.響應面試驗優化超聲輔助提取金銀花葉黃酮工藝及其抗氧化活性[J].食品科學，2016，37（6）：13-19.

[12] Jin H M，Tan X H，Cai W，et al.Optimization of extraction technology of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata using response surface methodology[J].Journal of Food Safety and Quality，2015，6（5）：1575-1582.

作者簡介：王妮（1996-），女，本科，實驗師，從事天然產物活性成分研究；趙二勞（1952-），男，本科，教授，從事天然產物活性成分研究。endprint