定向誘導間充質干細胞成軟骨分化相關活性因子研究進展

陳錦富 耿倚云 王大平

【提要】 關節軟骨受損或缺失，是導致關節炎等漸進性疾病的主要原因，嚴重影響患者生活質量。成熟的透明軟骨由于缺乏神經支配和血管供應，且軟骨細胞增殖能力差，所以很難自我修復。自體軟骨細胞移植尚存在局限性，且操作復雜，阻礙了臨床應用。間充質干細胞增殖能力較強，并保留有分化潛力，但向成軟骨分化需要一定的條件，如細胞因子、支架材料、培養基等。尋找促進誘導間充質干細胞成軟骨分化的活性因子，是目前關節軟骨再生的重要研究方向。本文就誘導間充質干細胞向軟骨分化的相關活性因子的研究進展進行綜述。

關節軟骨缺乏血管和神經，損傷后較難修復，傳統的微骨折術、軟骨移植術等治療效果并不理想。所以，組織工程技術再生關節軟骨成為研究焦點。間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）能夠多向分化，且來源廣泛、取材方便、損傷小、免疫原性低、增殖迅速、表型穩定，能夠在體外定向分化并用于軟骨修復。在誘導間充質干細胞向軟骨分化的過程中，細胞因子具有重要的調控作用，但該作用的具體機制尚不清楚。已有研究顯示，細胞因子能使MSCs處于一種前軟骨濃縮的狀態，促進細胞的增殖，并向軟骨細胞分化，這與胚胎時期的枝芽形成相似。在這種狀態中，MSCs將表達Sox9，這是軟骨形成的關鍵調節因素[1]。目前，尋找有效的方法來生成成熟的透明軟骨依賴于識別和操縱信號傳導通路，從而促進干細胞向軟骨分化和軟骨形成[2]。本文將針對誘導MSCs成軟骨分化的細胞因子和其他活性因子研究進展進行綜述。

1 經典細胞因子

1.1 轉化生長因子-β（TGF-β）

TGF-β是一組能調節細胞生長和分化的超家族因子。除了 TGF-β 之外，還包括活化素（Activins）、抑制素（Inhibins）和骨形成蛋白（BMPs），在軟骨形成的所有階段都非常重要。但是，也有研究認為TGF-β不需要全程添加[3]。通過研究水凝膠中的MSCs與TGF-β的接觸時間發現，TGF-β主要作用于誘導干細胞分化的前、中期。目前認為，TGF-β除了具有促進軟骨細胞增殖和維持軟骨細胞肥大化的作用外，還在關節軟骨的維護和修復中具有重要作用[4]，且TGFs在防止軟骨細胞去分化和促進細胞生長方面是有效的[5]，TGF-β通路已被證明在成骨和成軟骨分化體系中具有重要作用[6]。Roelen等[7]發現并進一步證實了TGF-β信號傳導在Smad3通路中具有重要作用，因為TGF-β通過Smad3通路可以抑制MSCs向脂肪分化，阻斷了Smad 3介導的TGF-β信號傳導致成脂分化。TGF-β也可以激活MAPKs（絲裂原活化蛋白激酶）路徑，MAPKs包括JNK、p38和ERK，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與大量的細胞活動，如增殖、炎癥、遷移和分化[8]，JNK、p38和ERK能夠通過不同的信號通路調節TGF-β，刺激間充質干細胞向軟骨分化及軟骨形成[9-10]，當TGF-β1過表達時，ERK、JNK和c-Jun的磷酸化水平會升高，而TGF-β1沉默時會明顯下降，這提示TGF-β1可以激活ERK/JNK的信號通路。最近的研究表明，維生素D可以促進Sox9、Col-Ⅱ、聚集蛋白聚糖和Col-Ⅹ的表達，從而誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞定向分化，TGF-β1通過激活ERK/JNK通路，提高了維生素D誘導骨髓間充質干細胞增殖、遷移和成軟骨分化的作用[11]。該發現對于MSCs治療由軟骨損傷導致的骨關節炎具有重要的應用價值。關于維生素D和TGF-β1之間相互作用的更多細節，以及這兩種信號傳導途徑的改變對于干細胞分化及治療的作用，還有待于進一步的研究證實。

1.2 骨形態蛋白（BMPs）

BMPs有20個成員，是TGF-β超家族的一員，是軟骨合成代謝、軟骨細胞再生中的主要活性因子之一，也能夠誘導間質干細胞成軟骨分化和軟骨骨化。其中 ，BMP2、4、6和7與誘導MSCs成軟骨分化有密切聯系，已經被證明可以促進膠原蛋白和其他軟骨細胞外基質蛋白的生成[12]。但是在軟骨形成的過程中，BMP7和BMP2、3、4和5都在軟骨膜中表達，只有BMP7在增生的軟骨細胞和成熟軟骨中表達[13]。研究表明，與其他骨形態蛋白相比，BMP7可能是一種更強大的生長因子。BMP7可作為一種強有力的合成代謝性因子，通過刺激體內成熟的軟骨細胞發揮抗凋亡作用，以促進細胞的存活[14]。多項研究顯示，BMP7可以促進間充質干細胞向脂肪、骨組織和軟骨分化[15-17]。BMP2已用于骨不連的臨床治療，并且具有極大的潛力可誘導軟骨形成，并可用于軟骨再生，修復軟骨缺損。BMP2已經被證明能誘導各種類型的干細胞分化，如hMSCs[18]、ADSCs[19]和小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）[20]等。 此外，BMP2已被證明比其他細胞因子，如 BMP4、BMP6、BMP7、TGF-β和IGF-1，更能誘導間充質干細胞成骨分化和成軟骨分化。有研究表明，BMP2可在體外的培養體系中自行誘發成軟骨分化、成骨分化。此外，BMP2在軟骨形成過程中可促進Sox9表達。因此，BMP2可被用于軟骨組織工程以調節軟骨的形成，但是為了保持軟骨的表型，必須對軟骨組織工程進行適當的調控[21]，例如低氧/HIF-1α對Sox9和Runx2的表達進行了調節，增強了BMP2誘導的成軟骨分化，抑制成骨分化和軟骨內骨化，并維持軟骨表型[22]。然而，在軟骨修復過程中軟骨表型的維持仍需要進一步的研究。

1.3 胰島素樣生長因子（IGF）

IGF能夠通過刺激細胞增殖、調節細胞凋亡和誘導軟骨細胞相關標志基因的表達來促進軟骨形成。IGF-I被認為是軟骨形成的重要生長因子之一[23]。據報道，IGF-I可以招募關節內軟骨細胞修復關節軟骨損傷[24]。研究表明，IGF-I能增強軟骨細胞的代謝，可以調節間充質干細胞向軟骨分化，同時保持間充質干細胞向軟骨分化的潛能[25]。但是，也有研究認為IGF-I對MSCs成軟骨分化的誘導沒有顯著的作用[26-27]。

1.4 成纖維細胞生長因子（FGFs）

FGFs是信號蛋白家族中的一員，FGFs及其受體（FGFRs）在MSCs向軟骨分化及軟骨形成過程中有重要作用，FGFs能促進軟骨細胞增殖并抑制其肥大化[28]。FGF信號分子及其細胞表面酪氨酸激酶受體與四肢發育早期階段的骨骼形成密切相關；抑制FGF信號會導致軟骨發育不良[29-30]。MSCs在體外培養時，FGF是促進其增殖及維持其分化潛能的主要細胞因子。FGF信號通路不僅與骨骼系統的發育有關，還與軟骨形成密切相關，有研究利用FGF9和FGF18基因敲除小鼠證明了FGFs是Runt相關的轉錄因子2（RUNX2）的上游細胞因子，并能促進未成熟的軟骨細胞增殖和成軟骨分化[31]。FGF在誘導MSCs成軟骨分化時，能夠提高軟骨微球中的蛋白多糖的生成。研究表明，FGF信號對胚胎軟骨發育具有非常重要的作用，FGF9基因突變的小鼠容易出現關節連接處軟骨畸形發育[32]。FGF已經被證明了能夠上調轉錄因子Sox2并抑制Wnt信號從而導致MSCs成骨分化能力下降。FGF在抑制Wnt信號的同時，還可以在早期階段促進MSCs向軟骨分化[33]。最近有研究通過分階段添加FGF誘導MSCs成軟骨分化，提示了在誘導分化的過程中，除了需要考慮不同細胞因子的生物作用外，還應該考慮添加誘導劑的時間，以利于更好調控成軟骨誘導分化[2]。

2 聯合應用

MSCs成軟骨分化需要多種細胞因子的調控，許多研究發現聯合使用不同的細胞因子比單獨使用一種細胞因子具有更優的促分化作用。TGF-β除了自身具有較強的誘導間充質干細胞向軟骨分化的作用外，還可以與其他細胞因子共同發揮作用。此外，TGF-β常應用于生物支架材料上，可以顯著地誘導間充質干細胞成軟骨分化。誘導MSCs成軟骨分化的研究中，BMPs經常與TGF-β1或TGF-β3組合，通過這些生長因子的組合，增強細胞內成軟骨相關信號通路和下游SOX9的激活，從而促進軟骨形成。研究表明，當TGF-β1單獨用于軟骨生成時，胚胎干細胞（ESC-MSC）與骨髓干細胞（BMSCs）相比，產生的與軟骨形成相關的細胞外基質較少。然而，通過補充BMP7到含有TGF-β1的培養基中，ESC-MSC可以產生大量的軟骨外基質[16]。與單獨使用TGF-β1相比，TGF-β1和BMP7的結合可能會促進ESC-MSC生成TGF-β1和TGF-β1受體，從而增強ESC-MSC向軟骨分化。此外，Lee等[34]的研究結果表明，當TGF-β1和BMP7一起誘導ESC-MSC成軟骨分化時，SMAD3和SMAD 1/5介導的信號通路都被激活，而單獨使用TGF-β1作為誘導劑時只能激活SMAD3。雖然TGF-β和BMPs可以協同作用于ESC-MSC，但其具體調控機制尚未確定。還有研究認為，IGF與TGF-β有協同作用，IGF-I可以通過提高TGF-β的代謝活性和抑制其細胞毒性來增強軟骨細胞和MSCs的成軟骨分化[35]。與單獨使用IGF誘導間充質干細胞成軟骨分化相比，增加了TGF-β因子的輔助后，膠原蛋白Ⅱ、聚蛋白多糖和Sox9的表達會明顯上升，有利于軟骨形成[36]。Du等[37]研發了一種FGF和TGF-β雙釋放水凝膠系統，證明了這種組合能夠增強MSCs成軟骨分化的能力。MSCs成軟骨分化是一個復雜的過程，需要多種因素的調控。目前，關于細胞因子調控作用的研究較為深入，但是其具體的調控機制尚未明確，聯合使用不同的細胞因子調控間充質干細胞成軟骨分化是當前研究的重要方向。

3 新型誘導因子

Kartogenin（KGN）是一種新型的小分子化合物，最初由Johnson等[38]在2012年發現，他們從22 000多種不同結構的雜環類藥物性化學分子中挑選出這種復合物，具有強大的促軟骨分化能力，能促進骨髓間充質干細胞定向成軟骨分化。KGN還具有良好的生物相容性及軟骨保護作用[39]。Lubricin是由軟骨細胞分泌到軟骨表面的一種黏液糖蛋白，具有保護軟骨的作用。Liu等[40]的體外研究發現，KGN與TGF-β1、BMP-7聯合使用能促進Lubricin生成。KGN與BMSCs及軟骨細胞共同培養，能夠提高Lubricin、膠原蛋白Ⅱ、葡糖氨基葡聚糖等合成，促進軟骨形成[41]。Shi等[42]發現，KGN在體外能促進滑膜間充質干細胞軟骨分化。目前，KGN促進成軟骨分化的具體機制尚未明確。

miRNAs是一種內源性非編碼小分子RNA，參與了細胞的多種生物活動，包括細胞的增殖、分化、凋亡等。Tian等[43]將miRNA-30a轉染至BMSCs后發現，Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白多糖等軟骨基質表達有所提高，能夠明顯促進BMSCs成軟骨分化。當抑制miRNA-30a后，促進分化的過程也被抑制。當miRNA-30a過度表達時，Delta-like 4（DLL4）在轉錄和翻譯的水平上表達下降，這也有利于促進MSC的成軟骨分化。Zhang等[44]發現，miRNA-410能夠結合Wnt3a基因位點，從而下調Wnt通路，促進BMSCs成軟骨分化，提示miRNA-410可能與干細胞的成軟骨分化有關。

Mg合金具有抗炎作用，能夠減少炎性因子的分泌，間接地促進間充質干細胞向軟骨細胞分化[45]。此外，Mg和Mg-Sr合金對兔BMSCs無細胞毒性，而且有促進增殖和成軟骨分化的作用，兩者的作用無明顯差別[46]。

4 總結與展望

MSCs向軟骨分化的潛能在軟骨再生的研究中具有無可替代的作用與廣闊的應用前景。提高誘導的效率與質量仍是研究的重點和亟待解決的問題。TGF-β、BMPs、IGF及FGF是目前研究較多、誘導作用較明確的生長因子。但是，MSCs向軟骨定向分化是需要多種因素共同調控的。所以，各種生長因子之間的相互作用，生長因子與培養體系的相互影響都需要進行更為深入的研究，以期獲得最適的組合，甚至研發出用于體內的緩釋體系，為臨床治療提供新方法，避免手術及關節腔內注射帶來的痛苦和并發癥。近年來，Kartogenin（KGN）、miRNAs等新型誘導因子已經應用在 MSCs成軟骨分化的研究當中，這給我們的研究提供了更多的方向，未來的深入研究也許能為軟骨損傷提供一種新的治療方式。