通心絡(luò)對2型糖尿病腎病大鼠纖溶調(diào)節(jié)因子PAI-1表達的影響

鄒大威 高彥彬 李嬌陽 周盛楠 張娜 吳曉明 田年秀 王曉磊 朱智耀

最新發(fā)表于《美國醫(yī)學(xué)會雜志》(JAMA)的一項研究顯示，2013年中國大陸成年人糖尿病的總患病率約為10.9%，糖尿病前期的患病率為35.7%[1]。2型糖尿病并發(fā)腎病的患病率為34.7%[2]，也是糖尿病患者致死致殘的主要原因。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，糖尿病患者血液處于高凝高粘狀態(tài)，由于血液黏度增高，血流緩慢，組織血液灌注量減少，致使組織缺血缺氧，局部代謝產(chǎn)物蓄積，導(dǎo)致腎內(nèi)微循環(huán)障礙。本研究在絡(luò)病學(xué)說指導(dǎo)下，基于中醫(yī)學(xué)“同病異治”理論，旨在探討通心絡(luò)對2型糖尿病腎病腎內(nèi)微循環(huán)、腎臟病理及腎功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠30只，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 干預(yù)藥物與試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)，通心絡(luò)超微粉(主藥為人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍等，由河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司提供)，鏈脲佐菌素(美國，sigma)，大鼠組織型纖溶酶原激活物Elisa試劑盒(CSB-E07917r，武漢華美)，大鼠纖溶酶原激活物抑制因子(CSB-E07948r，武漢華美)。

1.3 儀器

CareSens POP血糖儀(愛科來國際商貿(mào)有限公司)，自動血液流變儀(LBY-N6K，北京普利生儀器有限公司)，毛細血管黏度針(LBY-NW1，北京普利生儀器有限公司)，血凝儀(C2000-4，北京普利生儀器有限公司)，毛細管離心機(KH-120M，日本)，臺式離心機(TGL-16，上海安亭科學(xué)儀器廠)，血小板聚集儀(LBY-NJ4，北京普利生儀器有限公司)，卓越320、330全自動生化分析儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司)。

1.4 實驗方案

本實驗采用高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素建立2型DN 大鼠模型，隨機選取SD大鼠10只為空白組，其余20只大鼠予以高脂飼料飼養(yǎng)4周后，禁食12小時，按照35 mg/kg體重一次性腹腔注射1%的鏈脲佐菌素，72小時后大鼠尾靜脈取血測血糖，空腹血糖(fasting blood glucoce，F(xiàn)BG)≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功。造模成功的SD大鼠隨機分為模型組(10只，等量蒸餾水灌胃)，通心絡(luò)組[10只，生藥0.4 g/(kg·d)灌胃]；空白組(10只，等量蒸餾水灌胃)，實驗期間自由進食飲水，連續(xù)給藥16周。

1.5 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測

給藥16周末，各組大鼠尾靜脈取血測定血糖。禁食12小時后，次日清晨末次給藥后以10%的水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主動脈取血，部分血樣用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，抗凝全血用于血小板、全血黏度的測定；部分血樣3000 r/min離心15分鐘以分離血漿，用于血漿黏度和血漿纖維蛋白質(zhì)含量的測定。部分血樣不抗凝靜置2小時后分離血清測定肌酐、血清尿素氮及纖溶調(diào)節(jié)因子測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 通心絡(luò)對2型DN大鼠血糖、體重、腎功能的影響

如表1所示，與空白組相比，模型組大鼠的血糖明顯升高(P>0.05)、體重(body weight，BW)明顯降低(P<0.05)，通心絡(luò)能升高2型DN大鼠體重，但對血糖沒有影響(P>0.05)。與空白組相比，模型組大鼠的血肌酐、血尿素氮明顯升高(P<0.05)；通心絡(luò)給藥16周能夠降低DN大鼠血肌酐、 血尿素氮(P<0.05)，提示通心絡(luò)能夠保護2型DN大鼠腎功能。

表1 通心絡(luò)對2型DN大鼠血糖、體重及腎功能的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 通心絡(luò)對2型DN大鼠血液流變學(xué)的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 通心絡(luò)對2型DN大鼠血液流變學(xué)的影響

如表2所示，與空白組相比，糖尿病大鼠高、低切變率下的全血黏度、血漿黏度、血漿纖維蛋白原含量、血小板聚集率均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，通心絡(luò)干預(yù)降低上述血流變指標(biāo)(P<0.05)， 提示通心絡(luò)可通過改變血液流變學(xué)特性，降低血液的高凝狀態(tài)，增加腎組織的血液供應(yīng)，改善腎內(nèi)微循環(huán)。

2.3 通心絡(luò)對2型DN大鼠纖溶調(diào)節(jié)因子t-PA及PAI-1表達的影響

如表3所示，與空白組相比，模型組血漿組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogenemia activator, t-PA)降低，血漿纖溶酶原抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)增高；與模型組相比，給藥16周時通心絡(luò)組的血漿T-PA表達有升高的趨勢(P>0.05)，PAI-1明顯降低(P<0.05)。提示通心絡(luò)可通過降低血漿PAI-1水平，改善DN晚期大鼠纖溶活性，增加腎組織的血液供應(yīng)，改善腎內(nèi)微循環(huán)。

表3 通心絡(luò)對2型DN大鼠纖溶調(diào)節(jié)因子t-PA、PAI-1表達的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 通心絡(luò)對2型DN大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察可見：空白組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，腎小球基底膜均勻一致，足突排列整齊清晰，細胞外基質(zhì)區(qū)大小及系膜細胞數(shù)量正常；模型組：腎小球基底膜節(jié)段性不規(guī)則增厚，足突變形、低平甚至脫落，系膜基質(zhì)區(qū)擴大，系膜細胞增多，腎間質(zhì)區(qū)可見纖維化表現(xiàn)。通心絡(luò)組較模型組的病理變化程度有所減輕。見圖1。

3 討論

本實驗采用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素注射建立2型DN動物模型，DN以腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化為主要病理特征，臨床表現(xiàn)為尿蛋白增多及腎功能進行性惡化，本實驗表明通心絡(luò)具有保護腎功能、改善腎臟病理的作用。

DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。目前認為，DN會引起血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞源性血管活性因子表達失調(diào)、血管舒縮功能失調(diào)、抗凝功能降低，纖溶活性下降。血液流變學(xué)是反映血液循環(huán)的重要指標(biāo)，其變化反映血液黏滯性及凝固性的改變[3]。本實驗表明DN動物模型的全血黏度、血漿黏度、血小板聚集率以及纖維蛋白原均明顯增加，血液處于高粘高凝狀態(tài)；通心絡(luò)干預(yù)可增加腎臟血流，改善DN大鼠腎內(nèi)微循環(huán)。tPA和PAI-1是纖溶系統(tǒng)中非常關(guān)鍵的一對活性物質(zhì)，tPA是纖溶酶源激活劑，而PAI-1是絲氨酸蛋白酶抑制劑，可迅速與tPA結(jié)合使其失去活性，抑制纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，抑制血漿纖溶活性。另外，纖溶酶減少可抑制細胞外基質(zhì)的降解，促進細胞外基質(zhì)積聚，進一步加重腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[4]。本研究顯示通心絡(luò)能夠減少血漿PAI-1含量，增強纖溶活性，減輕DN大鼠腎纖維化，延緩DN進展。

DN臨床發(fā)病呈進行性進展，遷延難愈，易滯易瘀，與絡(luò)脈的結(jié)構(gòu)運行及功能、發(fā)病特點相一致。吳以嶺院士[5]認為糖尿病腎病病機是氣陰兩虛、陰虛燥熱、陰陽兩虛，消渴的早期是肺燥、胃熱多見，后期為腎虛，并繼發(fā)他臟病變，影響氣、血、水的運行，導(dǎo)致氣滯、血瘀、水停為病，邪阻于腎絡(luò)，則腎絡(luò)不暢，從而產(chǎn)生絡(luò)脈郁滯、絡(luò)脈瘀阻、絡(luò)脈瘀塞、絡(luò)息成積等主要病理變化。本病屬于“久病入絡(luò)”“久病多瘀”，可歸屬于“絡(luò)病”范疇。瘀血內(nèi)阻是糖尿病腎病的基本病理改變，病在絡(luò)脈是糖尿病腎病的中心環(huán)節(jié)。通心絡(luò)是吳院士在絡(luò)病理論指導(dǎo)下研發(fā)的中藥復(fù)方，主要成分包括人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸棗仁、冰片等十二味中藥，全方有益氣通絡(luò)、活血化瘀之效。人參為君藥，氣旺則血行，腎絡(luò)通暢，水蛭入絡(luò)活血、全蝎搜風(fēng)通絡(luò)止痙共為臣藥；佐以蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣等通絡(luò)蟲類藥收活血溫通，通絡(luò)止痙之功，冰片為使藥。臨床研究表明，通心絡(luò)能夠降低DN患者尿蛋白、保護腎功能，改善血流變特性[6-7]。中藥藥理研究表明人參具有抗纖維化的作用，全蝎、赤芍、水蛭具有抗凝、抗血栓、促纖溶、抑制血小板聚集的作用[8-10]；土鱉蟲、降香具有抗凝血作用[11-12]。通心絡(luò)能夠改善DN大鼠血液高凝高粘狀態(tài)，這與其他活血通絡(luò)復(fù)方的研究是一致的[13-15]。絡(luò)病是冠心病及糖尿病微血管并發(fā)癥等重大疾病的共性病理基礎(chǔ)。通心絡(luò)治療冠心病療效確切，同時能夠降低DN大鼠尿蛋白、保護腎功能，其對心、腎的共同保護作用體現(xiàn)了中醫(yī)“異病同治”的大法[16]。

綜上，通心絡(luò)具有抗凝、降纖的作用，可降低血液的高凝高黏狀態(tài)，改善腎臟局部微循環(huán)灌注，改善DN大鼠腎臟病理及保護腎功能，延緩DN進展。

[1] Wang L, Gao P, Zhang M, et al. Prevalence and Ethnic Pattern of Diabetes and Prediabetes in China in 2013[J]. JAMA, 2017,317(24):2515-2523.

[2] 中國2型糖尿病防治指南(2013年版)[J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版), 2015,7(3):30.

[3] 鄔宏紀, 吳旭芳. 糖尿病患者的血流變、血脂、纖維蛋白原等各項指標(biāo)的變化情況分析[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2015,13(11):1888-1889.

[4] 韓業(yè)宏, 許筠. 血漿tPA和PAI-1與糖尿病腎病的關(guān)系[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2013,34(10):1631-1632.

[5] 吳以嶺. 脈絡(luò)論[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社, 2010.

[6] 李桂娥,盧滿祥,蘇翠嫻,等.通心絡(luò)對糖尿病腎病血流變學(xué)和尿蛋白的影響[J]. 現(xiàn)代食品與藥品雜志, 2006,16(5):22-23.

[7] 龍軒, 王鋒, 黃昶荃. 通心絡(luò)膠囊治療糖尿病腎病的系統(tǒng)評價[J]. 中國循證醫(yī)學(xué)雜志, 2010,10(1):73-80.

[8] 潘雪, 馬端鑫, 李燕, 等. 水蛭藥理作用的研究進展[J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2015,43(14):24-25.

[9] 史磊,張?zhí)戾a,杜聰穎,等.中藥全蝎活性成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,17(4):89-91.

[10] 陸小華, 馬驍, 王建, 等. 赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J]. 中草藥, 2015,46(4):595-602.

[11] 王立娜, 王穎, 朱明珠, 等. 土鱉蟲的活性成分及藥理研究進展[J]. 化工時刊, 2017,31(6):34-36.

[12] 郭麗冰, 黃麗容, 趙麗華, 等. 降香行氣止痛、活血止血有效部位的藥理篩選[J]. 中藥材, 2007,30(6):696-698.

[13] 白璐, 張江華, 張晉升, 等. 益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對糖尿病腎病患者糖、脂代謝及血流變的影響[J]. 河北中醫(yī)藥學(xué)報, 2016,31(3):9-11.

[14] 楊芳, 李敬林, 生生, 等. 益氣解毒活絡(luò)中藥復(fù)方對早期糖尿病腎病大鼠血流變和纖維蛋白原的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2014,25(2):265-267.

[15] 吳中秋, 譚宏文, 丁敏, 等. 逐瘀通絡(luò)粉對早期糖尿病腎病患者血流變及尿微量白蛋白排泄率的影響[J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2007,41(10):31-33.

[16] 劉紅利, 郎艷松, 王宏濤. 通心絡(luò)膠囊治療心血管疾病研究進展[J]. 中國新藥雜志, 2014,23(15):1769-1772.