嵌合抗原受體修飾T細胞治療實體腫瘤研究進展*

孫祖俊 綜述，李冬 審校

200065上海，同濟大學附屬同濟醫院 檢驗科

目前臨床上對于惡性腫瘤的治療手段包括外科手術、放療、化療等，但仍有許多惡性腫瘤治療效果不甚理想，嚴重影響患者的生存期及生活質量。隨著人們對機體免疫系統在腫瘤發生發展作用的深入了解以及基因工程技術的進步，免疫治療越來越受到人們的重視，如通過體外修飾、擴增免疫細胞后回輸入患者體內，利用具有抗腫瘤活性的免疫細胞消滅體內腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的目的[1]。其中嵌合抗原受體修飾的T細胞(chimeric antigen receptor,CAR-T)成為腫瘤免疫治療領域研究的熱點，為惡性腫瘤的治療帶來新的方向，尤其在血液系統惡性腫瘤治療領域取得了顯著療效。然而對于患者更多的實體瘤研究，由于實體腫瘤微環境中的免疫抑制分子及基質屏障的限制，雖然報道較多，但報道中CAR-T細胞治療實體腫瘤效果依然缺乏實質性進展。本文擬就CAR-T細胞應用于實體腫瘤治療的最新研究進展進行綜述。

1 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)基本結構

CAR的基本結構主要包括三部分：胞外抗原結合區決定其特異性，負責特異性識別靶細胞表面的特異性抗原，由單鏈可變區序列(single-chain variable fragment,scFv)組成；跨膜區連接胞外區和胞內區，在 T 細胞活化過程中起著重要的作用，由CD4、CD8和CD28等構成；胞內區為信號轉導區，將胞外區和胞內區的信號傳導結構域相偶聯，由TCR/CD3ζ 鏈、免疫球蛋白Fc受體FcεRIγ 鏈組成，其中含有免疫受體酪氨酸活化基序( ITAMs)[2]。

2 CAR的發展

CAR的結構受益于基因工程技術的發展而得以改進，如今已發展到第4代。第1代CAR通過綁定區上的抗原受體能夠識別靶抗原并激活T細胞；第2代CAR的信號區添加了一個協同刺激分子；第3代CAR在胞內信號區整合了2個或2個以上的協同刺激分子；第4代CAR在第3代CAR的結構基礎上進行了改進，通過增加編碼CAR的基因及其啟動子的載體提高其效應。CAR-T是指通過基因工程技術構建CAR的質粒轉移到T細胞，使T細胞表面表達特定的抗原受體。CAR-T的作用機理是通過抗原結合區識別對應的抗原，通過TCRζ向胞內傳導TCR樣的信號，最終 T細胞能夠持續活化，保持持續的增殖能力及持續分泌細胞因子的能力，從而產生強烈的免疫應答反應，對腫瘤細胞起到特異高效的殺傷[3-4]。

3 CAR-T細胞在實體腫瘤治療中的應用

免疫治療已成為繼手術治療、化學治療和放射治療之后的第四大腫瘤治療方法，并且免疫治療發展迅速，其主要通過提高患者的免疫系統功能，達到治療腫瘤、抑制腫瘤復發及轉移的目的。腫瘤特異性抗原受體修飾的CAR-T細胞能夠特異性識別腫瘤抗原、高效殺傷腫瘤細胞。近年來CAR-T細胞在治療肺癌、肝癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及膠質母細胞瘤等實體惡性腫瘤方面取得了顯著療效。

3.1 肺癌

肺癌是許多國家男性發病率和死亡率均占第1位的惡性腫瘤，發現時大多處于中晚期，因此失去手術治愈的機會。目前化療是肺癌的主要治療方法，免疫治療在肺癌的治療中越來越受到人們的重視。

大多數非小細胞肺癌基質成分是腫瘤相關成纖維細胞，腫瘤相關成纖維細胞通過分泌心肌營養素樣細胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)和白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)產生旁分泌效應，在肺癌的發生、發展過程中起著重要作用[5]。Kakarla等[6]構建了靶向成纖維細胞激活蛋白-α(fibroblast activation protein-α,FAP)特異性CAR-T細胞，用于治療肺癌細胞移植瘤小鼠模型。FAP CAR-T 細胞能夠上調荷瘤小鼠的固有免疫，產生免疫刺激分子，如干擾素伽瑪(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-13(Interleukin-13)及IL-6等，識別并殺傷FAP陽性的靶細胞，導致腫瘤溶解，但對FAP陰性的靶細胞沒有作用。另外，促紅細胞生成素肝細胞癌A2(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma A2,EphA2)表達于肺癌細胞表面，是非小細胞肺癌相關的抗原，通過構建EphA2 CAR-T來治療肺癌，平均有36.6%的T細胞表達EphA2-CAR，EphA2 CAR-T細胞能夠識別并殺傷EphA2陽性的靶細胞，但對EphA2陰性的靶細胞沒有作用。體內實驗研究發現，以上兩種CAR-T細胞都具有顯著的抗腫瘤活性，當FAP CAR-T細胞和EphA2 CAR-T細胞聯合使用時，雙重靶向腫瘤基質細胞和腫瘤細胞，兩者具有明顯的協同效應，并顯著延長小鼠生存期。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種跨膜糖蛋白，常常作為腫瘤發生發展的標志物。目前在中國進行的EGFR CAR-T細胞治療11例晚期復發/難治性肺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，結果發現EGFR CAR-T細胞能夠清除EGFR陽性的非小細胞肺癌患者體內的腫瘤細胞，其中有 2 名患者獲得部分緩解，5 名患者獲得完全緩解[7]。Wei等[8]設計的靶向前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)和粘蛋白1(mucin,MUC1)的CAR-T細胞能夠識別并有效殺傷肺癌細胞，明顯抑制肺癌細胞異種移植瘤的生長，當PSCA CAR-T與MUC1 CAR-T細胞聯合使用后抑制腫瘤生長的效果更加顯著。以上研究為CAR-T治療肺癌的臨床前應用提供了重要的實驗依據，因此，CAR-T細胞療法將來有望應用于肺癌的臨床治療。

3.2 肝癌

肝癌是指發生于肝臟的惡性腫瘤，死亡率較高，位于癌癥相關死亡的第3位。目前早期患者以手術為主，輔以化療和放射治療，對于中晚期患者，免疫治療已成為重要的輔助治療方法。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染是肝硬化和肝癌發生的重要危險因素，目前使用抗HBV藥物能夠有效地控制HBV復制，但不能徹底清除病毒。研究發現[9]，HBV在肝細胞內以其共價閉環DNA(covalent-tiyclosed circular DNA,cccDNA)作為模板來進行復制，因此cccDNA成為抑制HBV復制的重要靶點。以cccDNA CAR-T細胞治療感染HBV小鼠的模型研究發現，CAR-T 細胞在小鼠體內能夠大量擴增，并定位于病毒感染的肝臟部位，具有顯著的靶向性抗腫瘤作用，并延長小鼠生存期。Krebs等[10]構建的靶向cccDNA CAR-T細胞也能特異性識別并殺傷有HBV復制的肝癌細胞，抗腫瘤效果顯著。MUC1在肝癌細胞及肝癌組織中異常表達，通過構建靶向MUC1的CAR表達框，利用重組慢病毒感染Jurkat細胞株，即MUC1 CAR-Jurkat，結果發現MUC1 CAR-Jurkat能特異性識別MUC1分子并對MUC1高表達的肝癌細胞QGY-7701造成特異性殺傷，而對MUC1低表達的正常肝細胞基本不會造成損傷[11]。以癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)為靶點的CAR-T細胞治療CEA+肝轉移瘤的Ⅰ期臨床試驗，結果顯示具有顯著的抗腫瘤效果，其中1名患者病情穩定，治療23個月后仍存活[12-13]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC-3)在大部分肝癌中表達，但在正常肝組織中不表達，靶向GPC3 CAR-T細胞對GPC3+肝癌細胞具有靶向殺傷作用，并且在體內具有顯著的抗腫瘤作用[14]。另外，GPC3-CAR-T殺傷GPC3陽性的肝癌細胞具有顯著的特異性和有效性，顯著抑制肝癌細胞異種移植瘤的體內腫瘤生長，并且能夠抑制肝癌患者來源的GPC3陽性的移植瘤生長[15]。靶向AFP的CAR-T細胞能夠選擇性地脫顆粒，釋放細胞因子，裂解AFP陽性的肝癌細胞；體內研究發現，瘤內注射AFP CAR-T細胞能夠顯著縮小肝癌細胞異種移植瘤的腫瘤體積，靜脈輸注AFP CAR-T細胞能夠快速顯著地抑制肝癌細胞異種移植瘤的腫瘤生長，并且在腹腔內肝癌細胞異種移植瘤模型中還發現，AFP CAR-T細胞也具有很強的抗腫瘤活性[16]。因此，在肝癌免疫治療方面，CAR-T細胞療法有望成為一種安全、高效的新型治療手段。

3.3 結直腸癌

結直腸癌是消化道系統常見的惡性腫瘤，早期結直腸癌手術治療是常規治療手段，如果手術治療不徹底，腫瘤可能復發和轉移，免疫治療在結直腸癌術后治療中具有重要作用。

CEA是消化道系統腫瘤常見的腫瘤標志物，以CEA為靶點構建的CEA CAR-T細胞能夠提高CEA陽性的直腸癌細胞抗腫瘤免疫；與CEA陰性的結腸癌細胞相比，CEA陽性的結腸癌細胞產生IFN-γ及抑制腫瘤粘附的能力明顯增強[17]。臨床Ⅰ期試驗發現，通過靜脈輸注CEA CAR-T細胞治療CEA陽性、復發、難治性并伴有肝肺轉移的結直腸癌患者，10 例患者中有 7 例病情得到緩解，2 例病情穩定超過 30 周，2 例影像學診斷發現腫瘤體積縮小，大部分患者血清CEA水平顯著降低并長期保持在低水平，并且發現CAR-T細胞增殖并持久存在于患者的外周血中，這說明CEA CAR-T細胞治療結直腸癌效果顯著[18]。Parkhurst等[19]采用CEA特異性CAR-T治療結腸癌, 3 例轉移性結腸癌患者治療后血清CEA水平都顯著降低，其中 1 例患者臨床療效顯著，然而所有的患者都發生了嚴重的短暫性炎癥性結腸炎，這說明大劑量CAR-T細胞誘導了毒副反應的發生。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor,HER2/neu)表達于大部分結直腸癌組織中，Morgan等[20]靶向HER2 CAR-T細胞治療 1 例 3 年前經歷結腸切除術并伴有淋巴結浸潤及肝轉移的結腸癌患者，輸注后幾分鐘患者發生了急性肺毒性反應，血壓急劇降低，并于 5 天后死亡。因此，CAR-T 療法尚未能完全證明在結直腸癌患者治療上的安全性和有效性, 今后的研究需進一步地完善和深入，以有選擇性地消滅結直腸癌細胞，減少及避免對正常組織的影響。

3.4 前列腺癌

前列腺癌在中老年男性發病率和死亡率均較高，臨床上多采用保守治療。采用免疫療法治療前列腺癌近年來越來越受到人們的關注。

研究發現，前列腺癌細胞膜上表達前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)，因此，PSMA成為前列腺癌診斷及治療的重要靶點之一。Zhong等[21-22]構建的PSMA CAR-T 細胞可特異性識別并殺傷表達PSMA的前列腺癌細胞，抑制免疫缺陷小鼠異種移植瘤模型體內腫瘤的生長。Tanoue 等[23]采用HER2 CAR-T 細胞治療前列腺癌細胞PC-3異種移植瘤，發現抑制體內腫瘤生長效果顯著，并且小鼠的平均生存期延長 2 倍以上。上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一種跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細胞中過表達。Deng等[24]研究發現，EpCAM CAR-T細胞在體內外具有很強的抗前列腺癌活性，并且EpCAM CAR-T細胞治療能夠抑制EpCAM高表達的前列腺癌細胞PC3M和EpCAM低表達的前列腺癌細胞PC3異種移植瘤的生長及轉移，并顯著延長小鼠的生存期。PSMA CAR-T細胞能特異識別并殺傷表達PSCA的前列腺癌細胞，特異性分泌IFN-γ及IL-2，并且CAR-T細胞自身能夠增殖；體內治療前列腺荷瘤小鼠發現，治療組小鼠腫瘤體積顯著低于對照組并且生存期明顯延長[25]。臨床Ⅰ期研究發現[26]，5 位前列腺癌Ⅰ期患者接受PSMA CAR-T細胞治療后，有 2 位患者獲得部分緩解，血清中PSA水平分別降低50%和70%，并維持 78 天和 150 天以上，另外 3 位患者也獲得部分緩解。以上實驗結果提示CAR-T 細胞將來應用于前列腺癌的臨床治療的可行性。

3.5 乳腺癌

乳腺癌是發生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，目前已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。目前的治療主要采用局部治療與全身治療并重的治療模式，免疫治療屬于全身治療，能夠恢復和增強機體內部的抗病能力，在中晚期患者的臨床治療中得到廣泛應用。

研究發現[27-28]，HER-2 CAR-T細胞能夠識別并殺傷表達HER-2的乳腺癌細胞，并顯著抑制甚至徹底清除人乳腺癌細胞異種移植瘤，免疫組化顯示在縮小的腫瘤周圍聚集大量的CD3+T細胞。以MUC-1為靶點的CAR-T 細胞對MUC1陽性乳腺癌具有特異的細胞毒性作用，并顯著抑制人乳腺癌細胞異種移植瘤的生長[29]。以EGFR和MUC1雙靶點設計的CAR-T細胞能夠有效殺傷ErbB2陽性的乳腺癌細胞，而只有當靶細胞共表達ErbB2和MUC1時CAR-T細胞才能增殖[30]。α型葉酸受體(folate receptor-α,FRα)是一種錨定于細胞膜表面的單鏈糖蛋白，在正常組織表達較低，但在腫瘤組織中隨著腫瘤的發展而表達升高，靶向FRα CAR-T細胞能夠有效特異地殺傷中度表達FRα的乳腺癌細胞，顯著抑制人乳腺癌細胞移植的免疫缺陷小鼠體內腫瘤的生長；當將人乳腺癌細胞過表達FRα基因后，FRα CAR-T能夠更快速地縮小小鼠體內移植瘤的體積[31]。上述實驗為CAR-T 技術應用于乳腺癌臨床治療提供了實驗基礎，提示CAR-T 細胞免疫療法應用于乳腺癌臨床治療具有非常廣闊的前景。

3.6 卵巢癌

卵巢癌是婦科發病率和死亡率最高的疾病，嚴重威脅女性的健康。目前卵巢癌治療多以手術治療聯合化療等綜合治療為主，但療效欠佳，免疫治療在卵巢癌的治療上具有毒副作用小等許多優勢。

卵巢癌相關的腫瘤抗原包括FRα、HER2、NK細胞受體NKG2D的配體(NKG2DL)、間皮素(MESO)等。Kandalaft等[32]設計的靶向FRα CAR-T細胞與卵巢癌細胞共培養，結果在表達FRα的卵巢癌細胞共培養上清中檢測到高水平IFN-γ、IL-2及TNF-α的分泌；FRα CAR-T 細胞能夠直接高效地裂解表達FRα的卵巢癌細胞，但對FRα陰性的黑色素瘤細胞沒有作用；體內實驗發現FRα CAR-T細胞治療能夠明顯縮小小鼠體內卵巢腫瘤的體積，并且帶有免疫共刺激分子的二代FRα CAR-T細胞比一代FRα CAR-T細胞治療具有更好的抑瘤效果。另外，在卵巢癌肺轉移小鼠模型中發現，FRα CAR-T細胞治療14天后，所有小鼠肺轉移病灶得到抑制，80%的小鼠在1月后沒有復發，而對照組小鼠病情進一步惡化。在一項應用FRα CAR-T細胞治療復發的卵巢癌細胞異種移植小鼠模型實驗中發現[33]，FRα CAR-T細胞的抑瘤活性和在體內存活時間方面均優于HER2 CAR-T細胞。同時對NKG2D CAR-T細胞的抗腫瘤功能分別進行的體外和體內實驗分析發現，CAR-T細胞通過分泌IFN-γ而不是GM-CSF募集巨噬細胞到腫瘤微環境，促進巨噬細胞產生IL-12，激活 T 細胞及提高機體的免疫系統功能，從而特異性溶解卵巢癌細胞，減輕體內腫瘤負荷，發揮抗腫瘤作用；此時巨噬細胞表達高水平趨化因子受體(Chemokine receptor 2,CCR2)及產生大量CCR2配體CCL2[34]。研究發現[35]，靶向NKG2DL CAR-T細胞同樣具有抗卵巢癌的作用，原代人CD4+和CD8+NKG2D CAR-T細胞能有效識別并裂解NKG2DL陽性的卵巢癌細胞，引起炎癥細胞因子IFN-γ和TNF-α 的釋放，其表達水平與細胞表面表達NKG2DL水平成正相關，但是在NKG2DL陰性的卵巢癌細胞中并沒有觀察到這種活性。Koneru等[36]構建的MUC16 CAR-T細胞治療卵巢癌患者，發現該CAR-T細胞不僅能夠增強腫瘤細胞溶解，而且還能夠通過分泌IL-2浸入腫瘤微環境，提高機體內源性免疫應答反應，從而達到清除腫瘤的目的。Tanyi等[37]利用靶向MESO CAR-T細胞治療 1 例晚期復發轉移的 52 歲女性卵巢癌患者，21 天后腹部和骨盆CT成像顯示腫瘤有輕微的縮小，第 8 天左側胸水檢測到惡性腫瘤細胞，但在治療后的第 21 天和 26 天未檢測到惡性腫瘤細胞，另外在患者外周血、肝臟組織和腹膜取出的腫瘤組織中都檢測到MESO CAR-T細胞，并且血中IL-6水平顯著升高。以上的研究提示，CAR-T細胞免疫療法將來有望應用于卵巢癌的臨床治療。

3.7 膠質母細胞瘤

膠質母細胞瘤是星形細胞瘤中惡性程度最高、最具侵襲性的顱腦腫瘤，目前治療以手術、放療、化療及其他綜合治療為主，但復發率較高，預后仍不理想，免疫治療與放化療聯合使用有助于提高療效。

CD133是一種高度保守的跨膜糖蛋白，是許多人類惡性腫瘤干細胞表面標志物，包括惡性膠質母細胞瘤。研究發現[38]，靶向CD133 CAR-T細胞能夠在體內外殺傷CD133陽性的膠質母細胞瘤干細胞。抗人單克隆抗體mAb139能夠特異地識別神經膠質瘤干細胞表達的突變型EGFRvⅢ，Morgan等[39]基于mAb139設計的CAR-T細胞能特異識別EGFRvⅢ突變的神經膠質瘤干細胞和神經膠質瘤細胞，通過分泌大量效應細胞因子如IFN-γ等，裂解表達該突變抗原的靶細胞，具有顯著的抗腫瘤效應且能在體外大量擴增，而對表達野生型EGFRvⅢ的腫瘤細胞及人正常細胞沒有損傷作用。Miao等[40]設計的EGFRvⅢ CAR-T細胞能夠識別表達EGFRvⅢ抗原的D-270MG 細胞，并能夠遷移到D-270MG細胞誘導的小鼠膠質母細胞瘤處，顯著抑制小鼠腫瘤的生長和延長小鼠的生存期。EGFRvⅢ CAR-T 細胞能夠特異識別并顯著殺傷表達EGFR vⅢ的神經膠質瘤細胞，當效應細胞與靶細胞比為10：1時殺傷活性達60%，同時共培養上清中檢測到大量INF-γ的釋放，但在EGFR vⅢ陰性的膠質瘤細胞質中沒有觀察到這種作用；裸鼠移植瘤實驗發現EGFRvⅢ CAR-T細胞治療組3周后移植膠質母細胞瘤開始減小，而對照組小鼠腫瘤繼續生長[41]。肝素酶(heparinase,HPSE)由激活的CD4+T淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞及B淋巴細胞產生，當T淋巴細胞缺乏表達HPSE時能夠降解細胞外基質主要成分硫酸乙酰肝素，因此通過基因工程設計靶向HPSE的CAR-T來降解細胞外基質，促進T細胞浸潤及其抗腫瘤活性。小鼠移植膠質母細胞瘤模型實驗發現，HPSE CAR-T細胞治療組小鼠生存期明顯延長，在另一組動物實驗中發現HPSE CAR-T細胞治療組小鼠腫瘤處具有更多的T細胞浸潤，并且腫瘤重量也比對照組明顯減輕[42]。EphA2 CAR-T細胞與膠質瘤細胞共培養24 h后，在EphA2陽性的膠質瘤細胞上清液中IFN-γ和IL-2的水平顯著高于EphA2陰性的腫瘤細胞，并且EphA2 CAR-T細胞對靶細胞的細胞毒性也明顯高于EphA2陰性的腫瘤細胞；體內實驗發現，聯合免疫缺陷的小鼠大腦內注射膠質瘤細胞 7 天后，對照組小鼠持續生長，EphA2 CAR-T細胞治療組小鼠腫瘤消退，腫瘤部位生物體發光成像信號非常弱，治療組小鼠生存期比對照組小鼠顯著延長[43]。Hegde等[44]發現HER2/IL-13Rα2 雙特異性CAR-T 可抑制神經膠質瘤細胞免疫逃逸，并且能夠顯著增強效應因子的活性。

此外，還有以腫瘤相關抗原神經節苷脂GD2抗原為靶點的 CAR-T細胞治療神經母細胞瘤的臨床試驗[45]；以羥基脫水酶IX(carboxy-anhydrase-IX, CAIX) 抗原為靶點的CAR-T細胞治療腎癌[46]；以MUC1為靶點的 CAR-T細胞治療胰腺癌[47]；以MESO為靶點的CAR-T細胞用于治療小鼠原位惡性胸膜間皮瘤[48]；以αVβ6整合素為靶點的CAR-T細胞治療黑色素瘤[49]等大多數研究都取得了一定的臨床效果。最近研究發現[50]，CAR-T 細胞聯合抗PD-1抗體可以大大增強CAR-T細胞的抗腎癌效應，PD-1/CD28融合受體修飾的CAR-T細胞能夠逆轉PD-L1/PD-1的抑制信號，增強CAR-T細胞的治療作用，甚至優于抗PD-1阻斷抗體聯用的治療效果。

4 展 望

在以 T 細胞為基礎的腫瘤過繼性免疫治療領域，CAR-T 細胞治療的實驗結果顯示出明顯的優越性，但是目前CAR-T 細胞免疫療法尚未充分發揮其潛力，尤其是在中晚期實體瘤治療方面的臨床研究仍然很少，并且僅靠單一的CAR-T 細胞治療手段并不能真正有效應對，因此，如何克服腫瘤基質屏障及免疫抑制微環境、保持CAR-T 細胞持續性殺傷腫瘤細胞的能力以及臨床治療的安全性是目前CAR-T 細胞治療急需解決的難題。隨著基因工程技術的發展以及人們對免疫與腫瘤發生發展關系的深入研究，一些關鍵技術和問題將會得到解決，相信CAR-T 細胞一定會在實體腫瘤的免疫治療中發揮越來越重要的作用，CAR-T 細胞聯合其他治療方法必將成為實體腫瘤治療既安全又有效的方法。

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利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

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