糖尿病性視網膜病變基因治療的研究進展

姚謝怡+許迅

摘 要 糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病的最常見微血管并發(fā)癥之一，是一類可引起嚴重視力損害甚至失明的慢性、進展性眼部疾病。目前，DR治療有視網膜激光光凝、局部注射糖皮質激素類和抗血管內皮生長因子類藥物等方法，但它們均有局限性和副作用。近年來，隨著越來越多的DR相關基因標志物被發(fā)現以及基因載體得到優(yōu)化，一系列體內外實驗已顯示出了基因治療在減少視網膜新生血管、保護視網膜血管及神經功能和改變DR相關表觀基因修飾方面的作用。基因治療具有相對長效且副作用小的優(yōu)勢，有望成為DR的新型治療手段。

關鍵詞 糖尿病性視網膜病變 基因治療 新生血管

中圖分類號：R774.1； R587.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）23-0015-05

Progress of gene therapy in diabetic retinopathy

YAO Xieyi*， XU Xun**

（Department of Ophthalmology， Shanghai General Hospital， Shanghai Jiao Tong University； Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Disease； Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine， Shanghai 200080， China）

ABSTRACT Diabetic retinopathy （DR）， one of the major microvascular complications of diabetes mellitus， is a chronic and progressive sight-threatening ocular disease. Currently， the treatment of DR including laser photocoagulation， intravitreal injection of corticosteroid and anti-vascular endothelial growth factor agents has its limits and adverse effects. A number of studies have shown that the gene therapy can play an important role in retinal angiogenesis inhibition， vascular and neuronal protection and epigenetic modification related to DR with the identification of genetic biomarkers of DR and the optimization of different gene vectors. Gene therapy， which has a longer duration of therapeutic effect and potentially fewer adverse reactions， is expected to be a novel method for the treatment of DR.

KEY WORDS diabetic retinopathy； gene therapy； neovascularization

糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病的最常見微血管并發(fā)癥之一，是一類慢性、進展性的眼部疾病，已成為工作人群失明的首要原因。在罹患2型糖尿病>20年的患者中，>60%的患者會出現不同程度的視網膜病變[1]。隨著全球糖尿病患者數持續(xù)增加，DR的患病率也隨之升高。據估計，到2050年，單在美國>40歲人群中就將有1 600萬人出現DR的臨床表現，其中300多萬人將遭受嚴重視力損害，給社會及經濟帶來沉重的壓力[2]。

1 發(fā)病機制和治療現狀

DR的發(fā)病機制至今仍未得到完全闡明，現認為主要與晚期糖基化終末產物的堆積、多元醇通路的激活、氨基己糖通路的激活、蛋白激酶C通路的激活和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的激活相關。上述通路的激活均會最終導致氧化或硝化應激、慢性炎癥反應、微血管和線粒體功能障礙，促使DR發(fā)生和發(fā)展[3]。此外，視網膜神經元損害和膠質過度增生也與早期DR的發(fā)生相關[4]。

由于發(fā)病機制復雜，目前治療DR的方法，如視網膜激光光凝、局部注射糖皮質激素類和抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）類藥物、玻璃體切割術等，均有局限性和副作用。近年來受到極大關注的抗VEGF類藥物雖可顯著改善DR患者的視覺，但由于半衰期短、需重復注射以維持療效，因此會引起一系列的注射相關并發(fā)癥，包括眼內炎癥反應、眼出血和眼壓升高，甚至導致更嚴重的眼內炎[5]。抗VEGF類藥物治療的長期療效現也尚未得到明確，且隨著VEGF的水平下降，可能出現視網膜神經退行性變、脈絡膜毛細血管萎縮等情況。此外，并非所有DR患者均對抗VEGF類藥物治療敏感，臨床試驗顯示雷珠單抗0.3 mg治療僅能使34% ～ 45%的糖尿病性黃斑水腫患者的視覺獲得顯著改善[6]，而應答的不一致性可能與VEGF基因的多態(tài)性相關[7]。因此，臨床上仍迫切需要有新的、更有效的DR治療藥物和方法。

近年來有關DR的基因研究逐漸深入，主要包括候選基因研究、基因連鎖分析和全基因組關聯(lián)研究等，期望通過這些研究來尋找并解析不同的基因和單核苷酸變異、基因多態(tài)性與DR的易感性及其進展之間的關聯(lián)。隨著抗VEGF治療已逐漸成為新生血管性眼病的主要治療方法，VEGF基因的多態(tài)性得到廣泛研究，而另一些特定的候選基因如醛糖還原酶、內皮型一氧化氮、晚期糖基化終產物受體和促紅細胞生成素基因中的單核苷酸變異亦被發(fā)現在DR的發(fā)病機制中起著一定的作用[8]。endprint

2 基因治療的研究進展

基因治療是指用正確的、正常的核苷酸序列替代患者機體細胞中引起疾病的有缺陷的基因中的核苷酸序列，借助基因置換、基因修正、基因修飾和基因滅活等手段來糾正或補償致病基因，進而達到臨床治療目的的一種治療方法。在基因治療中，選用合適的載體將外源基因導入靶細胞非常重要。目前，基因轉移技術主要包括病毒依賴和非病毒依賴兩種方法。常用的病毒載體包括腺病毒相關病毒（adeno-associated virus， AAV）、腺病毒、慢病毒和單純皰疹病毒等，其中AAV具有宿主范圍廣、能轉染非分裂細胞、免疫原性低、可在體內持續(xù)表達和安全、無致病性的優(yōu)點。在眼部疾病的基因治療中，幾乎半數臨床試驗選用的載體均是AAV。作為唯一一種能有效轉染內層視網膜細胞的AAV血清型，AAV-2在DR基因治療研究中的應用最為廣泛[9]。非病毒依賴的基因轉移技術則借助現代理化方法將基因導入靶細胞，與病毒載體相比，人工合成的非病毒依賴載體的免疫原性較低，且安全性高。此外，非病毒載體可攜帶更大負荷量的基因，也更易大量制備。隨著材料科學和納米技術的迅速發(fā)展，非病毒載體的基因轉移效率正在被慢慢提高，有望更多地應用于基因治療[10]。

近年來，隨著越來越多的DR相關基因標志物被發(fā)現以及基因載體得到優(yōu)化，基因治療作為DR的一種新型治療手段正越來越受到關注。目前，DR的基因治療研究主要著眼于減少DR病程中的新生血管、保護視網膜血管及神經功能和改變DR相關表觀基因的修飾三個方面。

2.1 減少視網膜新生血管

促新生血管因子與抗新生血管因子間的失衡是引起視網膜新生血管的主要原因[11]，而視網膜新生血管是DR進展期的主要特征。阻止血管內皮細胞增生、重達促新生血管因子與抗新生血管因子間的平衡是DR基因治療的一大目標。

2.1.1 拮抗促新生血管因子

作為參與視網膜新生血管和血視網膜屏障損害的關鍵因子，VEGF是DR基因治療的一個重要靶點。sFlt-1是VEGF受體-1的可溶性剪接變異體，作為胞外誘餌受體可結合循環(huán)中的VEGF和胎盤生長因子，從而產生新生血管抑制作用。在一系列的臨床前研究中，sFlt-1均被作為抑制視網膜新生血管的基因治療靶點，經病毒載體轉染其基因片段后，視網膜的新生血管受到顯著的抑制[11-12]。此外，VEGF的作用也可在胞內被阻斷。Flt23k由Flt-1中的VEGF結合域2、3和內質網滯留信號序列組成，作為一種內感受器可同時阻斷VEGF的胞外信號通路并能在胞內降解VEGF[13]。一項近期完成的研究顯示，由AAV-2轉染的Flt23k可在小鼠眼部通過下調VEGF表達而抑制脈絡膜新生血管[14]，但詳盡的作用機制還需進一步的研究。

2.1.2 增加抗新生血管因子

除拮抗促新生血管因子外，外源性增加抗新生血管因子也可重達正常的血管形成狀態(tài)。目前，已獲研究的抗新生血管因子包括色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor， PEDF）、組織金屬蛋白酶抑制劑-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3， TIMP-3）、內皮抑素、血管抑素和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase type plasminogen activator， uPA）的氨基端片段等[15]。許多研究者在高氧誘導的視網膜病變動物模型中發(fā)現，通過在玻璃體腔內注入病毒載體轉染的PEDF、TIMP-3、血管抑素、uPA的氨基端片段或內皮抑素等基因均可下調視網膜中的VEGF表達，從而顯著減少視網膜新生血管[15]。Haurigot等[16]對同時具有非增殖性DR和視網膜新生血管的小鼠模型的玻璃體腔內注入AAV-2轉染的PEDF基因，結果發(fā)現單次注入即可獲得長效的PEDF表達，由此顯著抑制視網膜新生血管、恢復視網膜的正常的血管密度。另一項近期完成的研究也發(fā)現，在體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞和糖尿病小鼠視網膜中，使用新型載體pEPito轉染可使PEDF的過表達維持長達3個月，且此期間視網膜中的VEGF表達顯著降低，由葡萄糖轉運蛋白介導的葡萄糖轉運顯著減少，小膠質細胞的活性及其誘發(fā)的炎癥反應亦顯著減少[17]。

2.2 保護視網膜血管及神經功能

隨著對DR發(fā)病機制研究的深入，許多研究著眼于防止視網膜血管功能障礙和神經元細胞凋亡或損傷，在DR早期視網膜血管和神經損傷尚不嚴重時即采取保護性治療成為DR基因治療的一個新的切入點。

2.2.1 拮抗補體系統(tǒng)活化

正常的眼內環(huán)境中因含有抑制補體系統(tǒng)活化的因子，補體介導的通路均處于靜止狀態(tài)，而在罹患視網膜血管性疾病如DR時，眼內的補體系統(tǒng)會被異常激活，形成攻膜復合體（membrane attack complex， MAC）。在DR的進展過程中，MAC的過度產生一定程度上導致了血管內皮和神經元細胞的凋亡，而阻止MAC的形成及積聚可延緩DR的進展[18]。Adhi等[19]的研究發(fā)現，MAC的抑制劑可溶性CD59（soluble CD59， sCD59）具有保護神經元細胞免于損傷、同時維持血視網膜屏障完整性的作用：在鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病動物模型中，通過玻璃體腔內注入AAV-2/8轉染的sCD59基因可減少60%的視網膜血管滲漏；sCD59還可活化視網膜神經膠質細胞，后者能在短期內減少神經節(jié)細胞（retinal ganglion cell， RGC）的凋亡，但長期效應未知。

2.2.2 外源性補充神經營養(yǎng)因子

越來越多的研究表明，神經營養(yǎng)因子對視網膜神經元細胞和神經膠質細胞的存活及功能調節(jié)起著十分重要的作用。在這些神經營養(yǎng)因子中，腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）是DR進展中最為主要的抗神經元變性的保護因子，在缺氧環(huán)境下可增加興奮性神經遞質谷氨酸的攝取，并上調Müller細胞中的谷氨酸轉運體和谷氨酰胺合成酶的水平，起到神經保護作用[20]。Gong等[21]的研究發(fā)現，與未轉染組相比，玻璃體腔內注入AAV轉染的BDNF基因可提高糖尿病大鼠RGC細胞的存活率并改善其視網膜功能。endprint

2.2.3 減少氧化應激

氧化應激在DR的發(fā)病機制中起著重要的作用。在DR患者中，除一系列信號通路改變引起的活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）產生增加之外，抗氧化酶的活性及表達也顯著降低[22]。其中，錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase， MnSOD）是線粒體中的一種關鍵抗氧化酶，可將ROS轉變?yōu)槟茏杂煽缭骄€粒體膜的過氧化氫，從而減輕氧化應激。在糖尿病動物模型中，通過AAV轉染MnSOD基因可上調視網膜中的MnSOD水平及活性，從而顯著改善基底膜的厚度，并減少視網膜血管內皮細胞和周細胞的凋亡、減少高糖環(huán)境導致的氧化應激損害，對糖尿病引起的微血管病變起到重要的預防作用[23]。

2.2.4 其他

血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）是血管生成素家族的一員，與血管生成素-2在高糖環(huán)境下有血管和神經損傷作用不同，Ang-1是一種血管保護因子，與內皮Tie2受體結合后可減少VEGF的表達及其所導致的鈣黏蛋白降解，維持內皮細胞間的緊密連接，從而降低血管的通透性、減少血管滲漏。Cahoon等[24]的研究發(fā)現，在Ins2Akita小鼠的玻璃體腔內單次注入AAV-2轉染的COMP-Ang1基因可獲顯著且長效的微血管和神經損傷改善效果。

2.3 改變DR相關表觀基因修飾

表觀基因修飾在DR的發(fā)病機制中起著重要的作用，其可在不改變DNA序列的情況下沉默或激活特定基因位點，從而調節(jié)基因的表達。表觀基因修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的作用等，它們在糖尿病患者中均呈活躍狀態(tài)，且與代謝記憶的發(fā)生密切相關[25]。

微小RNA（microRNA， miRNA）在DR相關表觀基因修飾中起著重要作用。miRNA是一類小型非編碼RNA，可通過與各自的目標信使RNA結合來調節(jié)基因的表達。通過收集DR和非DR患者的血清、玻璃體和房水等標本進行檢測，一些在DR時表達水平發(fā)生顯著改變的miRNA已被發(fā)現[26]。一些以VEGF為作用靶點的miRNA如miR200b、miR-126、miR-15和let-7家族等可調控靶基因轉錄后的表達，下調VEGF和其他炎癥因子的水平，抑制視網膜新生血管和視網膜炎癥反應，為DR治療研究提供了新的方向[27-29]。另外，一些與核因子-κB通路應答相關的miRNA如miR146、miR155、miR132和miR-21等在DR的發(fā)病機制尤其是炎癥反應中也起著重要的作用[28]。這些研究結果均表明，miRNA是DR的重要生物標志物，可作為DR治療的新靶點。

3 基因治療的挑戰(zhàn)與展望

近年來，對惡性腫瘤等疾病，基因治療已逐漸步入臨床研究階段。眼部結構小且封閉，僅需相對低量的載體就能進行治療性基因轉染，加之血視網膜屏障的存在使得載體進入全身循環(huán)的量很少，形成了一個相對免疫豁免的環(huán)境，眼部成為基因治療相對理想的器官。隨著對DR相關基因背景研究的逐漸深入，越來越多的與DR相關基因標志物被發(fā)現，一系列體內外實驗結果均顯示出基因治療在DR中的潛在作用。

不過，基因治療必須考量載體的安全性與穩(wěn)定性，且治療過程中可能出現脫靶效應，使得非靶細胞也被轉染上外源性基因，從而引發(fā)一系列的不良反應，加之DR本身的發(fā)病機制復雜，對DR的基因治療研究現仍停留在體外及動物模型實驗階段，至今尚未進行過有關DR基因治療的臨床試驗。DR基因治療真正走入臨床還面臨巨大的挑戰(zhàn)，而克服阻礙仍主要有賴于基因治療相關技術的發(fā)展，包括提高病毒載體的安全性及有效性、人工合成具有高轉染率的非病毒載體和找到更安全、更有效的基因轉染方法等，同時繼續(xù)深入探索DR的發(fā)病機制、篩選與DR發(fā)生和發(fā)展密切相關的目的基因、關注miRNA在DR中的作用，尋找新的基因治療靶點。此外，一些新技術如CRISPR/Cas9技術的出現也將加快DR基因治療的發(fā)展[30]。目前，一項基因治療濕性老年性黃斑變性的臨床Ⅰ期單中心、隨機試驗已獲得可喜的結果，證實了眼內基因治療是一種相對長效及安全的治療方法[31]。相信在不久的未來，基因治療必會成為DR的新治療手段之一。

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