血鸚鵡TYR基因表達qPCR分析的引物設計與評估

孫學亮 高微微 石洪玥 方珍珍 梁健 季延濱 陳成勛 胡婷瑩

摘 要：為了解色素相關基因和體色之間的關系，應用實時熒光定量PCR（qPCR）技術分析血鸚鵡的酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）基因的表達譜，通過Primer 5 軟件設計擴增血鸚鵡TYR基因片段的引物并進行qPCR評估研究。結果顯示，引物TYR2F-TYR2R在qPCR擴增時，融解曲線為單一尖銳峰；標準曲線分析顯示，引物的擴增效率為103.3%，R2值為0.994。上述結果說明該對引物具有良好的擴增特異性和擴增效率，滿足了qPCR擴增的要求，該研究結果可為血鸚鵡TYR基因表達的qPCR分析奠定基礎。

關鍵詞：血鸚鵡；酪氨酸酶基因（TYR）；實時熒光定量PCR；融解曲線

中圖分類號：S965.8 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.014

Abstract： To understand the relationship between the related genes and body color pigment， the application of real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR） technical analysis blood parrot tyrosinase， tyrosinase， TYR） gene expression profile， this research designed blood parrot TYR gene primers and qPCR assessment through the Primer amplification 5 software. The results showed that the melting curve was a single sharp peak when the primer TYR2F-TYR2R was amplified by qPCR. The standard curve analysis showed that the amplification efficiency of primers was 103.3% and R2 was 0.994. The above results showed that the primers have good amplification specificity and amplification efficiency and meet the requirement of qPCR amplification. This study will lay a foundation for the qPCR analysis of TYR gene expression.

Key words： Amphilophus； tyrosinase gene （TYR）； real-time fluorescence quantitative PCR； melting curve

體色是魚類獨特的表型性狀和經濟性狀[1]， 觀賞魚類的體色和斑紋直接決定其觀賞價值和市場價值。隨著人們對觀賞魚要求的提高，如何增強觀賞魚的觀賞性成為一個重要的問題。許多魚類從仔魚階段到幼魚階段都會有一個“體色褪黑”的現象，如血鸚鵡魚、日本錦鯉、小丑魚等[2]。目前，生產中常利用體色完全褪黑的血鸚鵡進行揚色，然而，體色褪黑的程度往往不符合生產的需求，如血鸚鵡會出現返黑現象。因此，深入了解魚類體色褪黑的機制，尋找人工改良體色的方法，非常值得研究。

魚類體色的形成和維持受到一系列細胞、基因和生理因素的復雜調控[3]，其體色構成不僅與色素合成有關，更取決于所含色素細胞的種類、數量、分布及色素細胞之間的相互作用[4]。關于魚類色素細胞的分類目前有很多種說法，普遍認為，魚類色素細胞主要有6種類型：紅色素細胞、黃色素細胞、虹彩細胞、黑色素細胞、白色素細胞、藍色素細胞[5]。目前，已知腺苷酸環(huán)化酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶三種信號通路，都能調控黑色素合成，并且激活其中任意一個信號通路均能激活細胞增殖或黑色素顆粒的形成[6]。黑色素顆粒吸收特定波長的光使其體現為黑色，這是由酪氨酸和多巴胺通過一系列復雜的反應合成的[7]。具體過程可簡化為酪氨酸—多巴—多醌—多巴色素—5，6-二羥基吲哚酸或5，6-二羥基吲哚—5，6吲哚醌--真黑素[8]。

大量研究證明，有多個基因參與魚類色素細胞形成和色素細胞間的相互作用[5，9-12]，其中，在一系列復雜的基因中，酪氨酸酶（Tyrosinase， TYR）基因在黑色素形成中起著關鍵性作用，TYR是動物體內黑色素合成信號通路中最重要的限速酶之一[13]， 其表達量和活性水平決定著黑色素形成的種類和速度，若TYR提前終止轉錄，黑色素則無法合成，進而會造成白化現象等。

血鸚鵡魚（Blood parrot fish）是由紫紅火口（Cichlasoma synspilum）為母本、紅魔鬼魚為父本（Cichlasoma citrinellum）雜交而成的，屬淡水熱帶觀賞魚類，體形肥胖，全身鮮艷通紅。因其色彩艷麗，嘴型酷似鸚鵡嘴型而得名，因此深受魚迷們喜愛[14]。血鸚鵡魚的體色變化過程不同于其他觀賞魚品種，仔魚期為黑色，逐漸褪去變成黃色，添加色素后，魚體變紅。為了培養(yǎng)出高品質的觀賞魚，必須添加外源色素，但目前對于觀賞魚著色機理的研究還比較少。

實時熒光定量PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，qPCR）是指在反應體系中加入熒光分子，分析和檢測反應過程中的累積擴增產物，其結果可以用于定性和定量分析。qPCR 可以應用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測[15]。

為應用qPCR技術分析血鸚鵡的酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）基因的表達譜，本試驗通過擴增血鸚鵡TYR基因片段的引物并進行qPCR評估，旨在為血鸚鵡TYR基因的定量表達分析及魚類體色遺傳和體色改良研究積累資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試魚取自天津寶坻里自沽嘉禾田源養(yǎng)殖基地，經麻醉后，解剖其鰭、皮和眼，液氮中迅速冷凍后放入-80 ℃冰箱中，備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取 應用Trizol 試劑（上海生工生物工程技術服務有限公司）提取血鸚鵡的鰭、皮和眼3種組織的RNA。試驗步驟如下：加入適量Trizol研磨，靜置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心5 min取上清至離心管中；加入氯仿，振蕩混勻，靜置5 min，12 000 r·min-1離心15 min取上清；加等體積異丙醇，靜置10 min，12 000 r·min-1 離心10 min棄去上清；加入75%乙醇1 mL，離心15 min，棄乙醇，保留沉淀，干燥2 min，溶入DEPC水中，溶解后用超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）分析其純度；然后再在1%左右的普通瓊脂糖凝膠、5 V·cm-1 的恒壓電泳分離，凝膠成像系統觀察與拍照。

1.2.2 cDNA第一條鏈的合成 依照反轉錄試劑盒的說明書進行試驗，在離心管中加入1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，計算好標定為1 000 mg·μL-1的提取得到的RNA模板溶液，再加上ddH2O配平至10 μL，放入65 ℃水浴鍋中反應5 min，迅速冷卻，加4 μL 5×Prime ScriptⅡ Buffer，0.5 μL RNase lahibitor，1 μL Prime ScriptⅡRTase于離心管中，最后加入4.5 μL ddH2O于45 ℃水浴中反應45 min，95 ℃水浴5 min，冷卻，最后將得到的cDNA產物放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設計、常規(guī)PCR的篩選 依據GenBank公布的血鸚鵡近緣物種TYR的基因序列信息（GenBank號：KU308394.1），應用Primer 5.0 設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

取魚的鰭、皮和眼的cDNA進行TYR基因片段的常規(guī)PCR擴增。擴增體系為25 μL，包括cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，dNTP 2 μL， 合成的引物各4 μL，Taq 0.2 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35～40次。PCR產物經1%左右的瓊脂糖凝膠、5 V·cm-1 的恒壓電泳分離，凝膠成像系統觀察與拍照。之后對得到的TYR基因的單一PCR擴增產物進行雙向測序，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.4 qPCR引物的設計與評估 根據本試驗獲得的TYR基因序列以及qPCR擴增的引物設計原則，對用于qPCR分析的引物，經過常規(guī)PCR檢測后，進行qPCR擴增。

根據Real Master Mix（SYBR Green I）試劑盒說明書設計反應體系，對引物進行RT-PCR反應。PCR反應體系為6 μL ddH2O，0.4 μL ROXⅡ，0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，2 μL模板和10 μLSYBR。擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，一定的退火溫度退火30 s，72 ℃延伸25 s。共循環(huán)40次。

退火溫度的優(yōu)化：根據引物的Tm值，對TYR的基因片段進行qPCR擴增。每個反應為3個技術重復，同時進行融解分析，并設置陰性對照（用PCR水替代cDNA）。

標準曲線的建立：以cDNA原液為最高濃度，采用10倍稀釋法獲得5個不同濃度的cDNA模板（用PCR水替代cDNA）。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測結果

血鸚鵡鰭、皮和眼3種組織的總RNA經檢測顯示，28 S rRNA和18 S rRNA條帶亮度比值在1～2（圖1），OD260/OD280均在1.8～2.0。

2.2 引物的設計、常規(guī)PCR的篩選

根據GenBank檢索的血鸚鵡近緣物種TYR的基因序列，應用Primer 5.0引物設計得出的引物中，只有1對引物（表1）適宜進行PCR擴增。

以血鸚鵡鰭、皮、眼的cDNA為模板，對表1引物進行常規(guī)PCR擴增篩選。圖2結果顯示，引物TYR-F，TYR-R的擴增產物僅有一個擴增條帶（泳道1～3），大小與理論值相符。

對擴增后獲得的單一產物進行測序，其序列包含引物為293 bp。對該序列進行GenBank BLAST比對，結果顯示，TYR基因與已報道的近緣物種橘色雙冠麗魚的cDNA序列（GenBank號：KU308394.1）一致性為99%；與紫藍叮當的一致性為89%（GenBank號：AB178940.1）；與藍馬面的一致性為89%（GenBank號：AB178937.1）；與噴點珍珠虎的一致性為89%（GenBank號：AB178936.1）；與非洲慈鯛的一致性為89%（GenBank號：AB178939.1）（表2）。

2.3 qPCR引物的設計與評估

2.3.1 qPCR引物的設計 根據試驗所得的基因序列，設計并得到2對qPCR擴增的產物（表3）。

試驗所得的序列為：CGGGGCTACAGCCAAGAGCACTGTGTAACGCCACCGGGGAGGGTCCACTGTTACGTAATCCCGGTAACCATGATTCCAATCGTGTGCAACGAATTCCACTTCGGCTGATGTGGAGTTCACTTTGGGCCTCCCCGAGTACGAGACGGGAACCATGGACCGCTTTGCAACATGAGCTTTAGAAACGTATTAGAGGGTTTTGCAAGTCCAGAGACAGGTATGGCCCTGACAGGCCAGAGTACCATGCACAACTCCTTGCATA。

2.3.2 qPCR引物的評估 根據TYR1F-TYR1R和TYR2F-TYR2R的Tm值，進行qPCR溫度梯度試驗的擴增，結果顯示，TYR2F-TYR2R在退火溫度為57 ℃時的Ct值最小（表4），所以，引物TYR2F-TYR2R用于qPCR的擴增。

采用退火溫度57 ℃，應用引物TYR2F-TYR2R對系列稀釋cDNA樣本進行qPCR擴增，結果顯示，在指數擴增區(qū)相鄰的擴增曲線間隔相似（圖3-A），每個反應的融解曲線為單一尖銳峰（圖3-B），從標準曲線得出引物的擴增效率為103.3%，標準曲線的相關系數R2值為0.994（圖3-C）。

3 結論與討論

總RNA的純度和完整性關系到后面的cDNA合成及PCR擴增。因此，所提的總RNA要求純度高，完整性好并達到一定的濃度。本研究表明，從血鸚鵡中提取的總RNA樣本的28 S/18 S rRNA的條帶亮度比值在1～2，而OD260/OD280在1.8～2.0，沒有蛋白的污染。表明總RNA有較好的完整性，可用于后續(xù)的試驗。

引物的設計一般應遵循以下原則：引物的GC含量在50%～60%較為合適，避免序列中連續(xù)出現超過3個G或C重復片段；引物的Tm值在50～65 ℃之間，且上下游引物的Tm值的差在5 ℃以內，可增加PCR反應成功的可能性，引物自身和引物間不應存在互補序列，從而避免產生發(fā)夾結構和引物二聚體[16]；而對于qPCR擴增還要求擴增子的長度最好在75～200 bp之間，片段越長擴增效率越低。本試驗基于GenBank公布的血鸚鵡魚近緣物種所得的基因序列（KU308394.1），僅得到1對引物，即：TYR-F和TYR-R，擴增子理論大小值為293 bp，在常規(guī)PCR中，引物的擴增子理論大小值為293 bp與理論值相符且無雜帶，特異性較強。基于該引物序列，進一步設計用于qPCR試驗的引物，得到2對用于qPCR試驗的引物。擴增子理論大小值分別為112，161 bp。之后經過qPCR溫度梯度擴增試驗，結果顯示，TYR2F-TYR2R引物更適合用于qPCR的試驗。

在qPCR擴增時，每次均應設置陰性對照，且無擴增信號；所有的擴增樣本都應有2～3 個技術重復，同時技術重復樣本的Ct值的標準差應<0.5，否則應對樣本重新進行qPCR擴增。本試驗中的陰性對照均無擴增信號，qPCR擴增樣本的3個重復的Ct值標準差<0.5，說明了本試驗結果的可靠性。

退火溫度的高低影響引物與目標序列的退火，不適宜的退火溫度會導致非特異性擴增和引物二聚體的形成，因此，在qPCR試驗中，要進行退火溫度的優(yōu)化。引物擴增的特異性是qPCR分析成敗的關鍵，因此在進行退火溫度優(yōu)化的同時要進行融解分析，判斷引物擴增的特異性[17]。融解曲線若為單一尖銳峰，則表明引物的qPCR擴增為特異性反應；相反，如果在融解曲線上不只有一個波峰，則表明有非特異性的反應，應淘汰該引物[18]。依據本試驗引物的Tm值，經過優(yōu)化，結果顯示，退火溫度為57 ℃時，qPCR擴增的Ct值最小，故選擇57 ℃作為退火溫度對引物進行擴增效率的檢測。

引物除了具有擴增特異性外還應具有良好的擴增效率，才能最終用于試驗樣本的qPCR 分析。qPCR的擴增效率一般通過建立標準曲線來確定，而標準曲線可通過對一系列倍比稀釋的cDNA模板進行qPCR而得出。擴增標準：擴增曲線應間隔均勻、理想的擴增效率在90%～105%、標準曲線的決定系數（R2）>0.980[19-20]。本試驗結果顯示，引物TYR2F-TYR2R在qPCR擴增時，融解曲線為單一尖銳峰；標準曲線分析顯示：引物的擴增效率為103.3%，R2值為0.994。上述結果說明，該對引物具有良好的擴增特異性和擴增效率，滿足了qPCR擴增的要求。

通過對引物TYR2F-TYR2R的退火溫度優(yōu)化和標準曲線的建立，結果表明，該引物可適用于樣本的qPCR分析，這一研究將為TYR基因表達量與血鸚鵡體色變化的關系及研究鸚鵡魚體色形成機制提供理論依據。

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