飲用天然礦泉水中糞鏈球菌檢測的能力驗證

□ 李 娟 張詩慧 陳 科 蘇嘉妮 廣東省食品檢驗所

檢測人員能力驗證是實驗室微生物檢測質量控制的關鍵環節，其結果直接關系到檢驗報告的準確性和可靠性。通過能力驗證，可以綜合判斷檢測人員的檢測水平，進而體現該實驗室的檢測水平。能力驗證作為評價實驗室能力的一個重要手段，一直以來受到國內外實驗室管理者的廣泛重視[1]。它對于實驗室而言是重要的外部質量保證手段，能增加客戶及相關方對實驗室出具可靠數據的信心。

糞鏈球菌（Streptococcus faecalis），又名糞腸球菌（Enterococcusfaecalis），在水、土壤和人畜的體內及糞便中廣泛存在[2]，屬于條件致病菌，當機體抵抗力下降或有其他因素影響時，進入人體血液或其他部位，可引起尿路感染、敗血癥、腦膜炎、化膿性腹部感染、心內膜炎和腹瀉發燒等[3]。該菌耐熱、耐鹽，對不利環境的適應性強、抵抗力強，甚至可以抵抗多種抗生素，因此存活力持久、感染性強[4]，與大腸菌群相比，該菌更適合作為水質糞便污染情況的指標菌，更能客觀地反映水質的衛生狀況[5]。本文就包裝礦泉水中糞鏈球菌的定量檢測對本實驗室兩名檢測人員進行能力驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）ATCC29212，購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心，工作菌株為3代，大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922購自Microbiologics，工作菌株為2代。

1.2 主要試劑與儀器

KF鏈球菌瓊脂培養基（北京陸橋）、腦-心浸萃液態培養基（北京陸橋）、腦-心浸萃瓊脂培養基（北京陸橋），抽濾設備（Millipore）、無菌濾膜（Millipore）、恒溫培養箱（上海一恒）、旋渦混合器（IKA）。

1.3 檢驗方法

1.3.1 制備菌懸液

用無菌棉簽沾取糞鏈球菌陽性菌株至3 mL生理鹽水管中，測定麥氏濁度，并進行稀釋.

1.3.2 陽性污染

各吸取1 mL菌懸液至250 mL礦泉水中，混勻。

1.3.3 過濾

用無菌鑷子夾取0.45 μm無菌濾膜至濾床上，固定好無菌濾器，將250 mL污染樣品倒入無菌濾器中，啟動抽濾裝置，完成后將濾膜轉移到KF鏈球菌瓊脂培養基上，注意放置時要避免在濾膜和培養基之間夾留有氣泡，36 ℃倒置培養48 h。

1.3.4 計數

記錄典型菌落數，糞鏈球菌在KF鏈球菌瓊脂培養基上呈紅色或粉紅色菌落。

1.3.5 鏡檢

分別挑取不少于5個典型菌落進行革蘭染色，首先挑取菌落涂薄片，用酒精燈灼燒片刻固定，后用結晶紫染色1 min，自來水沖洗，碘液媒染1 min，自來水沖洗，95 %酒精脫色30 s，自來水沖洗，沙黃復染1 min。糞鏈球菌為革蘭氏陽性球菌，常排列成短鏈狀。

1.3.6 確證試驗

同時接種到腦-心浸萃瓊脂培養基，36 ℃培養48 h，若有菌生長，進行3%過氧化氫酶試驗，若無氣泡產生，則轉接到腦-心浸萃液態培養基及膽汁液態培養基中，分別于45 ℃、36 ℃培養48 h、3 d，觀察是否能生長繁殖。糞鏈球菌為過氧化氫酶陰性，在上述培養基中均能生長。

2 結果

2.1 樣品污染

菌懸液麥氏濁度為0.51，稀釋6倍，各吸取0.7 mL至250 mL待測礦泉水中。

2.2 計數

檢測人員A所做的KF平板上典型菌落數為33個，檢測人員B所做的KF平板上典型菌落數為21個。

2.3 鏡檢

檢測人員A挑取的5個典型菌落均為革蘭氏陽性球菌，并排列成短鏈狀；檢測人員B挑取的5個典型菌落均為革蘭氏陽性球菌，并排列成短鏈狀。

2.4 確證試驗

檢測人員A挑取的5個典型菌落在腦-心浸萃瓊脂培養基上有生長，3%過氧化氫酶試驗陰性，在腦-心浸萃液態培養基及膽汁液態培養基中均能生長繁殖；檢測人員B挑取的5個典型菌落在腦-心浸萃瓊脂培養基上有生長，3%過氧化氫酶試驗陰性，在腦-心浸萃液態培養基及膽汁液態培養基中均能生長繁殖。

2.5 結果與報告

檢測人員A的檢測結果為33 CFU/250 mL，檢測人員B的檢測結果為21 CFU/250 mL。

3 結論

兩次獨立試驗的對數值之差的絕對值為0.20，小于0.45[6-7]，結果為滿意，表明A、B檢測人員檢測礦泉水中糞鏈球菌的能力符合質量控制要求。

4 討論

水為生命之源，在人的生命活動中不可或缺。但隨著工業化的普及，飲用水的安全問題變得越來越突出，而其中最重要的問題之一便是飲用水的微生物污染，飲用水一旦受到污染，將會引起大規模感染和疾病的爆發[8]。

大腸菌群定植于人及溫血動物的腸道中，通過腸道排泄物污染水質，進而傳播疾病，但經過氯消毒、污水處理和高濃度鹽的環境中，大腸菌群可能多數已失活，所以大腸菌群并不能很好地反映水質的糞便污染情況。而糞鏈球菌的抵抗力強于大腸菌群，將糞鏈球菌作為衡量水質衛生質量的指標菌更具有衛生學意義，現行有效的國家標準《飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB8538-2016）將糞鏈球菌納入檢驗指標菌。李飛等研究人員在廣東省采集206份水樣，開展糞鏈球菌的污染調查，調查顯示有35份水樣有糞鏈球菌污染，污染率為17%[9],因此飲用水中衛生指標菌糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等的監測至關重要。

開展此次能力驗證，旨在考核本實驗室試驗人員的檢測能力，找出檢測過程的薄弱之處，發現問題，解決問題，提高實驗室檢測人員對食品微生物檢驗和細菌性疾病診斷的應急能力，促進實驗室檢驗水平的不斷提高[10]。本實驗室還將有序地進行其他食品微生物檢驗的能力驗證，以保證本實驗室檢測人員穩定的檢測水平。

[1]江志杰,高春.化妝品中金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢出能力驗證結果與分析[J].香料香精化妝品,2015(6):29-32,36.

[2]周玲,李秀貴,王子桂.一起食用甜白酒所致糞鏈球菌食物中毒[J].中國衛生檢驗雜志,1991(3):180-181.

[3]成曉維,唐食明,游淑珠.水中糞鏈球菌的檢測研究[J].科技資訊,2010(15):223-225.

[4]于泓洋,劉燕霏,楊建德.糞鏈球菌的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫,2012(17):97-98.

[5]張淑紅,吳清平,張菊梅,等.水中糞鏈球菌顯色培養基-濾膜法快速檢測初步研究[J].中國衛生檢驗雜志,2008(9):1718-1720,1731.

[6]中華人民共和國,國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.食品和動物飼料微生物學30℃菌落計數方法:SN/T1800-2006[S].北京:中國標準出版社,2006.

[7]B Standards.Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of microorganismsColony-count technique[S].Iso international Standard,2006.

[8]李飛.包裝飲用泉水食源性致病菌分布規律和遺傳多樣性研究[D].廣州:華南理工大學,2013.

[9]李飛,吳清平,張菊梅,等.礦泉水和山泉水中糞鏈球菌污染調查及主要污染菌株的ERIC-PCR分型研究[J].微生物學通報,2013(5):881-890.

[10]肖波,周陽,孫松松.食品中副溶血性弧菌檢測能力驗證分析[J].預防醫學情報雜志,2017(5):447-449.