PCR技術在食品微生物檢測中的運用

□ 劉 杰 陳 璐 華測檢測認證集團股份有限公司

微生物的含量在食品安全中有十分重要的作用，在近些年來，一些地方環境的污染導致原生的食物中含有一定量的污染成分，直接導致食品安全受到影響。在這些食品當中，存在的有害菌群遠遠超出允許范圍值，甚至有些食物中存在微量的致病微生物[1]。食品安全和每個人的切身利益息息相關，是群眾最為關心的民生問題之一，強化對食品的微生物檢測工作既專業又有必要性。本文結合我國近年來在微生物的檢測中做出的努力，深入探討PCR技術如何在食品安全中起到把關的作用。

1 微生物檢測的發展情況

我國的法律已經明確了對食品藥品的檢驗方式，在食品的檢測中對微生物的檢測有著嚴格的限定和標準。在行業標準和國家標準的規定下，檢測人員根據相應的物理和化學指標對食品進行抽樣檢測。根據微生物的菌群種類和含量進行比對區分，用檢測的數據與標準相互對照，判定食品的質量，并且認定是否能夠食用。但是，在日常的檢測中常出現檢測人員難以達到技術要求、檢測儀器滿足不了認定要求和對微生物種類判定存在疑問的情況。首先是在現有的條件下，能夠具有較高專業素質和檢測水平的人員數量與實際需求數量相差較大。在實驗室環境中，要求檢測人員工作細心，且能夠在檢測過程有較強的責任心，這對檢測人員的素質有較高的要求。實驗室處于無菌的環境，任何的失誤和違規動作都會給試驗結果帶來不同的結果，直接導致實驗結果的不真實、不可信[2]。此外，在檢測中儀器的使用也是關鍵因素。按照標準對儀器進行定期的標定和校準，準備詳細的實驗儀器相關參數信息，以備在實驗中隨時使用，定期對儀器進行保養維護。尤其需要注意的是在極溫環境下的儀器養護，過高溫度、過低溫度、濕度過大或者干燥的環境都要保證精密儀器的恒溫恒壓恒濕環境，這樣才能保證儀器使用準確。對于微生物種類的判斷也是檢測的關鍵一環，每種微生物的檢測標準和菌落培養方式不同，利用菌落的采集和稀釋，得到培養基中的菌落成分。但是流程如此，在操作中就存在很多不方便之處，必須要求在操作過程中強化監督管理，確保流程合規。在傳統的食物微生物檢測中還是有很多的操作不足之處，使用PCR可以在很大程度上解決這些問題。

2 PCR技術的推廣使用

2.1 在大腸桿菌檢測中的應用

大腸桿菌作為食物中常見的菌類對人體危害較大，同時大腸桿菌的繁殖能力強，在有一定培養基礎下都能進行大量繁殖。在傳統的檢測中，對于大腸桿菌較難檢測出準確的數值。在使用PCR技術中，根據多重的篩選辨別后，利用賀毒素的靶向基因序列，對大腸桿菌的溶血細胞因子和多糖結構分子進行靶向標定。經過免疫的化學反應，最終得到多基因的類大腸桿菌，實驗人員根據采集食物中的不同大腸桿菌數量，形成0157∶H7的比對基因序列，達到找尋大腸桿菌基因序列的目的，再使用血清法的比對參考，最終用PCR技術得到更為精確的檢測結果[3]。

2.2 在幽門螺桿菌檢測中的應用

幽門螺桿菌對人體的胃環境有較大的危害，長期菌群指標超標對胃黏膜有很強的迫害性。使用多重環境下的PCR技術，可以對螺桿菌的血清進行比對鑒定，對于基因中的脫氧核苷酸序列進行比對，利用異性基因的引物效應，重新構建新的PCR環境，在檢測的比選中，根據多重的PCR技術和一重PCR技術相互對比，在兩者出現較為明顯的差異性時，可以判斷出此時的菌類含量較高，食物不滿足食用的標準。當兩者比對相近時，利用基因的靈敏性研究結論，可以知道幽門螺桿菌處于靜止未擴散的情況。利用此方式可以將禽類活體中的螺桿菌標記。實驗結果顯示陽性，則表示實際情況與實驗結果相同，但是出現陰性，實驗指標會發生調整。根據大量的實驗結果證明，利用PCR檢測標記的菌類有更高的準確率。

2.3 在金色葡萄球菌檢測中的應用

金色葡萄球菌常常出現在蔬菜和水果當中，這類致病菌類在經過變異之后，一般農藥很難殺除，而且在一般環境下會產生大量的繁殖，繁殖后產生SE類型的毒素，這類毒素給人帶來最為直接的后果就是造成食物中毒。利用基因環境下的PCR檢測技術，可以在蔬果中直接檢測到金色葡萄球桿菌，利用線性核糖核酸的耐熱酶效應，轉為常規的基因序列，在免疫的條件下對菌類進行比對，根據不同菌類的靈敏度和特異度，從而實現PCR檢測的真實性。在實際的操作中，PCR檢測可以將檢測的準確度控制在正負

1 pg的范圍內。

2.4 在乳酸菌檢測中的應用

乳酸菌是一種非致病菌，可生長在真空環境中。應用PCR 檢測真空包裝中的微生物可以明確食品腐敗與否，影響到食品食用安全。有研究人員采用rRNA ISR 與16S rRNA 構建出PCR對真空包裝中的牛肉相關腐敗乳酸菌進行檢測，還有檢測人員使用變性梯度凝膠電泳法檢測，得到的結果一致。均證明了隨發酵時間延長檢出率提高。實驗過程構建出了PCR 有著較好的重復性，且解決了rRNA 不能重復檢測泡菜中乳酸菌的問題。

3 PCR技術改進技術

在使用PCR技術過程中，對于微生物的環境要加以控制，包括在微生物的檢測中，標準試驗用品和對照標準都要嚴格遵照國家規范進行，以保證后期檢驗結果的真實性。在實驗的過程中，利用PCR技術對質量的控制要使得結果和實驗的操作相互對應，嚴格要求無菌環境下的比對基因方式。在此基礎上衍生出PCR相關改良技術，對微生物的檢測同樣達到很好的檢測效果。

實時定量PCR 技術，是將熒光基團加到PCR 反應系統中，運用熒光信號積累，對整個PCR 過程實時檢測，最后用標準曲線定量未知模板，這種方法就叫實時定量PCR 技術。該法是在完全閉管情況下檢測，而且結合此檢測技術以及平穩無干預的熒光激發光源，在PCR 后不需再進行處理，有效防止交叉傳染。該法運用縮短了檢測周期，操作簡便，檢測時能做到準確、特異。給食品加工時檢測外源DNA 受到污染的定量，在檢測病原微生物、檢測摻假量以及檢測轉基因食物等方面起到了有效作用。

4 結語

利用分子生物學技術檢測食源性致病菌的方式發展迅速，尤其是PCR技術及在其基礎上發展起來的眾多新技術，可以使檢測成本降低，效率更高，準確度更高。傳統的檢測方法檢測致病菌需要經過生化和血清學等多個步驟，操作繁瑣，耗時費力，靈敏度低，并且傳統方法無法檢測難以人工培養的微生物。PCR 反應的最大特點是擴增效率高和靈敏度高。本文還對實時定量PCR 技術進行簡要的介紹，利用防止交叉感染的方式在避免出現污染的情況下有效地彌補了基礎PCR技術在使用中的不足之處，更好地發揮PCR在食品微生物的檢驗效果。

[1]江飛,張旭偉.PCR 技術在食品檢測中的應用和發展[J].河南農業2017(6):156-157.

[2]李富威,張舒亞,曾慶坤,等.乳制品中水牛乳成分的實時熒光PCR檢測技術[J].2013(2):247-252.

[3]胡博.PCR 技術在食品微生物檢測中的應用[J].現代食品,2017(4):36-37..