實時熒光定量PCR技術在食品檢驗中的應用

□ 李秋陽 姚 瑤 北京出入境檢驗檢疫局

在PCR指數擴增過程中，借助強弱不同的連續監測熒光信號及時測定異性產物量，將此作為依據，測出目的基因拷貝數。定量PCR技術從產生開始至逐步完善，不再是最初的單一染料法，演變成特異性比較高的Fret、Taq man等探針法，隨著Taq man探針廣泛使用，這種方法也被稱為實時定量PCR的方法。

1 實時熒光定量PCR技術基本原理

PCR反應循環次數越來越多，反應中生成的DNA拷貝數呈指數級增長，且逐步轉入平臺期，在此期間，實時熒光定量PCR動態檢測整體PCR反應流程，不斷分析及擴增有關熒光信號，緊隨反應動態測出熒光信號變化，通過電腦自動繪制成一條曲線，以檢測指數期特定點PCR產物量，經過推斷，得出模板最初含量[1]。熒光閾值將PCR反應開始前循環熒光信號前15個用作熒光本底信號，通常超過熒光閾值檢測到的熒光信號是一個值得信賴的信號，將其作為定義樣本Ct值，也就是在PCR循環時，各反應管中熒光信號至指定閾值過程中需要經歷的循環數。從研究情況看，各模板Ct值和該模板起始拷貝數是一種線性的關系，具體來說是一種對數線性關系，起始拷貝數與Ct值呈反比。根據已經得知的起始拷貝數的標準樣品便能繪制出標準曲線，所以，僅需要得到未知樣品Ct值，便能算出樣品的起始拷貝數。

2 食品檢驗中實時熒光定量PCR技術的應用

2.1 實時熒光定量PCR技術在轉基因食品檢測中的應用

全球范圍內，轉基因作物種植面積越來越大。經過批準可用作加工原料的轉基因作物有玉米、大豆等。轉基因食品在給人們帶來經濟效益的同時，也讓食品營養更多樣。而轉基因作物存在一定的環境及生態問題，經過加工制成的食品，對人類健康的影響受到人們關注。甲基化檢測與SNP檢測等基因分型：Realtime PCR一般使用兩種方式，一種是探針法（Taq man probe），另外一種是熒光染料摻入法（Sybr green），在PCR反應體系中加入過量SYBR熒光染料，當該染料特異性地摻入DNA雙鏈時，就會發射熒光信號，沒有摻入鏈中的SYBR染料則不發射任何的熒光信號。基因表達差異分析：如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異（如藥物處理、物理處理、化學處理），特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的確證。轉基因食品不斷增多，需要強化監測及控制工作。轉基因產品檢測包括下述三點：

（1）明確是否是轉基因產品，是否需要進行定性檢測；（2）經過鑒定，確定轉基因產品品系；（3）監測轉基因產品含量[2]。

RQ-PCR技術的應用，較好地滿足了轉基因產品檢測的需求。RQ-PCR技術普遍應用在多種農作物檢測當中，如轉基因玉米、大豆等，當前轉基因作物中具有獨特的啟動子35S、耐除草劑基因EPSPS，用于確定是否為轉基因產品。

2.2 實時熒光定量PCR技術在食物加工過程中外源DNA污染定量中的應用

（1）檢測摻假量。因為相比蛋白質，DNA的熱穩定性更高，和免疫學檢測技術相比，PCR技術應用過程中，無須借助特異性抗體。相比特異性抗體的合成時間，它的制備時間更久，因此，RQ-PCR技術在食品摻假量檢測方面是一種不錯的選擇。SandbergM等人把RQ-PCR技術用于谷物基因定量檢測當中，也將缺乏麥麩嬰兒食物控制在有效范圍。

（2）檢測病原微生物。人們十分注重食源性微生物的檢測。應用PCR技術能更好地測出病原體。在實驗當中，由于受到污染會發生假陽性，所以普通PCR并不用作標準。RQ-PCR靈敏度較高，被推廣應用于食源性微生物檢測當中，同時，能夠定量測定致病菌污染程度。如葡萄中一般存在曲霉菌污染，有一定的毒性，Mule G等人將RQ-PCR技術用于測定葡萄中曲霉菌污染程度。通過此項技術還能夠測出朊蛋白基因種特異性DNA序列，這是其他一些技術不能做到的。

3 結束語

PCR技術能夠短時間擴增各期單的DNA片斷，在實際應用中具有重要價值。傳統的PCR容易遭受污染，不能正確定量，而實時熒光定量PCR技術具有較好的特異性、靈敏度，能夠快速反應。RTQ-PCR技術逐步優化，它為食品行業提供了重要的檢測工具。相信隨著科學技術的發展，未來實時熒光定量PCR技術將更加成熟，能夠較好保證食品檢驗的科學性及準確性。

[1]吳永彬,肖維威,馬文麗.實時熒光定量PCR技術在轉基因食品檢測領域中的應用[J].生物技術通訊,2011,22(4):575-579.

[2]沈赟.實時熒光定量PCR技術在食品檢驗中的應用[J].江蘇預防醫學,2006,17(4):85-86.