外泌體研究進展及潛在的轉化途徑

崔永春，祁 磊，李 波，羅曉康，羅承良，王 欣，唐 躍

（1中國醫學科學院北京協和醫學院國家心血管病中心，阜外醫院心血管在體實驗及評價中心，心血管植入材料臨床前研究評價北京市重點實驗室，心血管疾病國家重點實驗室，北京100037；2蘇州大學醫學部法醫學系，蘇州215123；3哈佛醫學院布萊根婦女醫院神經外科系，波士頓馬薩諸塞州02115）

0 引言

外泌體（exosome，Exo）是細胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑為30～150 nm，具有典型的脂質雙分子層膜結構，存在于細胞培養上清液、血漿、血清、唾液、尿液、羊水和惡性腹水以及其它生物體液中。在機體多種生理病理過程中發揮重要作用，是近些年來生物醫學領域研究的熱點問題［1-3］。隨著基礎和臨床研究技術的發展，外泌體的面紗正在被層層撥開，對它的認識也在逐漸深入。本文將對外泌體的相關研究進展作一綜述，全面了解外泌體獨特的生物學結構、功能及其潛在的轉化途徑，不僅有助于進一步了解細胞的基本生理代謝和病理改變，而且對臨床疾病的診斷和治療也有重要的指導意義。

1 外泌體的生物起源、運輸與釋放

外泌體的生成是一個連續性的過程。首先，細胞外物質或細胞膜蛋白經內吞形成早期內體（early endosomes），經細胞內運輸逐漸成熟為晚期內體（late endosomes），在某種生理病理條件下，晚期內體的界膜多處向內凹陷，形成蛋白運輸與分揀中心-多囊體（multi-vesicle bodys， MVBs）。 在 MVBs的形成過程中涉及了20多種囊泡分揀蛋白，其中最重要的是4種內體運輸分揀復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）和液泡蛋白分選因子（vacuolar protein soaing 4，Vps4）。 MVBs既可以與溶酶體融合，其內容物經溶酶體降解排出細胞外，也可以內出芽方式形成管腔內的囊泡（intralumenal vesicles，ILVs），直接與胞膜融合，在ESCRTⅢ型收縮及剪切芽頸幫助下脫落，釋放入細胞外環境，形成外泌體。釋放至細胞間質的外泌體會再次通過內吞作用或配體-受體識別模式進入受體細胞，將“貨物”釋放入受體細胞胞質后，發揮信號傳導作用，也可以重新形成 MVBs或直接與細胞質膜融合，進行下一個循環［4］。

2 外泌體的生物學特點

外泌體外膜富含膽固醇、鞘脂、神經酰胺、糖脂GM3和長飽和脂肪酰基的甘油磷脂鏈，在細胞微環境中發揮重要作用。廣泛分布于人體各種體液。來源于不同細胞的外泌體表面攜有相似的保守蛋白，如MHCⅠ類和／或Ⅱ類分子、熱休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白（如 CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101）、整合素、細胞骨架蛋白以及一些生物酶類［5-7］。

外泌體內部載有母細胞特異性生物學物質，如膽固醇、蛋白質、mRNA、microRNA等生物信息。這些物質不僅能夠反映其來源細胞類型，更重要的是，還與其來源細胞的生理功能或病理改變密切相關。最早時，外泌體只被認為是細胞的“垃圾袋”，讓細胞擺脫一些無用蛋白，但在最近數年研究中發現，外泌體所攜帶的“貨物”具有重要的生物學意義，尤其外泌體所包含的許多RNA分子已被證實會參與腫瘤發生、病毒感染、神經退行性等重要疾病過程。

正是外泌體的這些表面蛋白和內部包含的特異性生物學物質決定外泌體具有異質性、穩定性的特征，此外，外泌體含有特殊的信號通道，所以還具有靶向性和運輸性的特點。外泌體的這些生物特性為外泌體的體外研究、臨床應用提供了可能［8］。

3 外泌體的生物學功能

來源于不同細胞的外泌體在不同的生理、病理階段具有不同的功能。現已知的外泌體作用分為以下兩方面。①母細胞：質量控制，選擇性釋放細胞內有害物質，維持細胞內環境穩態，保持細胞活力。②受體細胞：作為多種信號的傳遞體，外泌體介導細胞-細胞之間的信息交流；既可近距離影響鄰近細胞，也可遠距離進行系統調控。

4 外泌體的發展歷程及幾次重大突破

1986年，Eberhard G．Trams和 R．M．Johnstone在體外培養的綿羊紅細胞培養液上清中首次發現了一種有膜結構的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）。隨后的10年，外泌體并未受到足夠的重視。1996年，Raposo等報道了關于EVs功能，闡明了B淋巴細胞通過釋放含有Ⅱ型主要組織相容性復合物（MHC）Ⅱ的外泌體誘導的抗原特異性MHCⅡ類限制性T細胞反應，這是外泌體領域獲得的第一個重大突破［9］。

此后，研究人員逐漸對外泌體產生了極大的好奇。2007年，Jan Lotvall等創造了外泌體研究的第二個突破，即外泌體內含有的可變RNA如miRNA，非編碼長RNA（lncRNA）和mRNA可以在細胞之間轉運。在2010年，三個研究小組均證明了這些miRNA可以轉移到 standby細胞，并能夠在胞內發揮作用［10］。第三個突破是2013年的諾貝爾生理或醫學獎獲得者：美國科學家James E．Rothman和Randy W．Schekman，德國科學家 Thomas C．Südhof，他們發現了細胞內部囊泡（外泌體等）運輸調控機制使外泌體的研究達到全新的高度，成為近些年來生物醫學領域研究的熱點。

5 外泌體在不同疾病中的研究進展

國內學者對外泌體的研究涉及領域廣泛，包括腫瘤外泌體 PKM2［11-15］、人骨髓間充質干細胞［16-18］、血小板外泌體與慢性皮膚損傷［19］、YAP信號通路、GPX1、肝臟損傷［20-22］、心臟損傷［23］、去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer， CRPC）［24］、敗血癥［25］、乙肝病毒 X 蛋白［26］、Zika 病毒［27］、血管重塑［28］等多系統疾病。下面主要介紹外泌體在幾種典型疾病中的研究進展。

5．1 外泌體在腫瘤疾病中的研究進展 目前，已有越來越多的學者研究［11-15］證實，外泌體在腫瘤發生、發展、診斷及治療等領域發揮重要作用。2015年德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的一項研究在6月24日的《自然》（Nature）雜志上發布，研究發現存在于癌癥外泌體上的glypican-1（GPC1）基因編碼蛋白或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測有可能適合手術治療階段的早期胰腺癌。因此，癌癥外泌體不僅是一種生物標記物，而且分離出它們還可為我們提供一個癌癥特異性信息的寶庫［29］。這些由腫瘤釋放的外泌體，在腫瘤患者的體液中是非常豐富的，它們在促進腫瘤生長和進展中起到了關鍵作用。例如，NCI-H460腫瘤細胞系釋放的外泌體中包含EMMPRIN（一種在腫瘤細胞內高表達的跨膜糖蛋白），這種跨膜糖蛋白可以促進成纖維細胞中的基質金屬蛋白酶的表達，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。腫瘤細胞外泌體還含有活性的Wnt蛋白、P-選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1），這些蛋白可以調整腫瘤的進展及血栓形成等過程。雖然這些研究成果對于研發阻止腫瘤細胞轉移的新治療方法有重要意義。但是，迄今為止，腫瘤細胞有活性的外泌體是如何釋放的機制尚不十分清楚。

2017年1月9日，Nature Communications雜志發表了來自南京大學張辰宇、曾科課題組、南京中醫藥大學胡剛課題組以及美國佐治亞州立大學Yuan Liu課題組的研究成果，他們發現，PKM2的磷酸化和二聚體化不僅可以轉換腫瘤細胞代謝從氧化磷酸化到無氧糖酵解，還可以通過直接磷酸化SNAP23促進腫瘤細胞外泌體的分泌。

5．2 外泌體在神經系統疾病中的研究進展 南京醫科大學鼓樓醫院徐運教授、基礎醫學院生理系陳玲教授的研究［30］發現，血清外泌體 miR-9和 miR-124的表達水平有助于診斷急性缺血性卒中和評估缺血性損傷的程度。這項研究的目的是檢測急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者血清的外泌體濃度的改變和血清外泌體中2個腦特異性miRNAs（miR-9和miR-124）水平的變化，并探討這些miRNAs在AIS診斷和損傷評估方面的價值。實驗發現，與對照組相比，AIS患者血清中的外泌體濃度及外泌體 miR-9和 miR-124水平明顯升高（p＜0．01）。 而且，miR-9和miR-124的血清水平與血清IL-6濃度、腦梗死面積、健康卒中量表（NIHSS）分數呈顯著正相關。因此，得出結論，血清外泌體miR-9和miR-124的水平有希望作為生物標志物用于診斷AIS和評估缺血性腦損傷程度。但是，對于外泌體在AIS中的作用及作用機制未做深入研究。外泌體在腦卒中疾病中的作用除了是生物標志物外，還有治療作用［31］。

5．3 外泌體在心血管疾病中的研究進展 心臟在缺血、缺氧、持續高血壓刺激后，心肌細胞會經歷凋亡和壞死，這是一個導致心臟功能障礙最終心臟衰竭的關鍵病理過程［32-33］。 大量研究［34-36］表明，干細胞來源的外泌體對心肌梗死及心肌缺血／再灌注損傷引發的心肌細胞凋亡具有非常顯著的保護作用。過表達GATA-4的骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）來源的外泌體富含血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor， PDGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor， FGF），也可以通過上調miR-19a，在缺血心肌中起減少氧化應激，減輕炎癥傷害［37］，促進血管生成和抗心肌細胞凋亡的作用。阜外醫院楊躍進教授在研究中介紹了各類細胞外泌體在干細胞治療缺血性心臟病中的作用［38］。此外，心肌細胞本身也可以分泌外泌體，此類外泌體富集HSP20，能夠通過激活血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）促進人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）增殖，遷移和血管形成［39-42］。

6 外泌體的臨床轉化潛能及展望

綜合分析外泌體的整個生物發生過程、生物學特點以及在不同疾病中的作用機制，外泌體代表了潛在的治療干預靶標。外泌體臨床轉化可選擇的關鍵環節包括：外泌體的生物合成或者釋放；特定“貨物”分揀；外泌體與靶細胞之間的相互作用，或者抑制靶細胞攝取外泌體。展望其今后的臨床應用，外泌體潛在的臨床轉化途徑包括兩方面。

6．1 母體細胞的生理病理狀態生物標志物 外泌體

包含來源于母體細胞的內容物，由于外泌體膜與來源細胞的胞膜具有同源性，可以體現母體細胞的不同生理病理狀態。因此，利用胞膜上大量富集的蛋白進行分析能夠提高診斷率。目前尿液標本的生物標志物比較常見，比如急慢性腎炎的尿液標志物胎球蛋白

A，較傳統的肌苷酸標志物更早出現異常。尿液來源外泌體中活化轉錄因子可能是急性腎小管損傷的新型生物標記物，腎母細胞瘤抑制基因則可能是慢性腎臟疾病相關足突狀細胞特異性損傷標志物。基于外泌體標志物而建立起來的腫瘤診斷新方法有望為臨床應用提供更加便捷、準確、靈敏的診斷依據。

6．2 外泌體作為藥物載體 外泌體作為一種天然的脂質體還是一種比較理想的藥物載體［43］，憑借它自身特有的定向歸巢能力，可以穿過細胞膜將所承載的物質運送至靶細胞，能夠逃避宿主免疫系統，可被靶細胞特異性吸收。外泌體還能進行膜修飾從而增強細胞特異性靶向作用，例如加載了β分泌酶（betasecretase1，BACE1）siRNA的外泌體可穿過血腦屏障，將大腦神經元、小膠質細胞和少突細胞中BACE1的mRNA及蛋白表達下調60%左右。此外，外泌體還具有足夠時長的循環半衰期、無毒性，且能夠加載多種不同的藥物，是一種很有應用前景的細胞質量控制和疾病防控新工具。

7 外泌體臨床轉化的局限性

雖然作為生物標志物，外泌體已經初步顯示其優越性，但仍有一些問題需要注意。首先，由于外泌體內載物含量較少，因此需要有足夠靈敏的檢測儀器，才能使外泌體作為生物標志物成為可能。其次，由于體液樣本本身也有與外泌體相似組分，因此外泌體的分離和純化尤為重要。最后，體液中包含來源于各種類型組織和細胞的外泌體，如正常體內提取的血漿外泌體可能來源于紅細胞、白細胞或血小板，以及與血液循環直接或間接接觸的組織細胞。若想解讀血漿來源外泌體所攜帶的生物信息，需要廣大臨床和基礎研究者繼續深入研究，不斷發現不同類型細胞特異性外泌體的表型特征，對外泌體來源細胞進行篩選。

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