蛹蟲草固體培養產子實體條件的優化及其蟲草素含量測定

刁朝強，文庭池，廖 勇，康冀川，周建云，謝紅艷

(1.貴州省煙草公司貴陽市公司，貴州 貴陽 550025；2.山東省農業科學院農業資源與環境研究所，農業部廢棄物基質化利用重點實驗室，山東省農業面源污染防控重點實驗室，山東 濟南 250100；3.貴州大學西南藥用生物資源教育部工程研究中心 貴州 貴陽 550025)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Fr.)是麥角菌科的藥用蟲生真菌，是我國名貴的中藥和新資源食品[1]，其所含藥用成分和多種藥效可與冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk.) Sacc.)相媲美。特別是其活性成分蟲草酸和蟲草素含量明顯高于冬蟲夏草[2]，使其得到廣泛關注。蟲草素即3’-脫氧腺苷是蛹蟲草產生的一種重要的次生代謝產物，據文獻報道其對枯草桿菌(Bacillussubtilis(Ehr) Cohn)、鳥型結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosisvar.aviumLehm.et Neum)、鼠艾氏腹水疣、人鼻咽癌KB細胞、人表皮樣疣及Hela細胞等皆有明顯拮抗或抑制作用[2]。經國內有關單位多次對蛹蟲草進行的藥理藥化及臨床實驗證明[3]，其具有重要的滋補價值，對慢性支氣管炎、肝炎、高血壓、心臟病、腎炎、腎衰、癌癥以及消除疲勞、緊張等有顯著治療和預防作用。

張顯科等[4]通過實驗得出，大米栽培的蛹蟲草和野生冬蟲夏草含的重要無機元素，尤其是人體必須的無機元素，兩者含量很接近。蛹蟲草中各種維生素的含量比冬蟲夏草高，有的高出幾倍。兩者均含有18種氨基酸，蛹蟲草中每種氨基酸含量幾乎均高于天然冬蟲夏草，氨基酸總含量也高出冬蟲夏草幾倍。蛹蟲草中蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和超氧化物歧化酶(SOD)的含量接近或高出冬蟲夏草的含量。李楠[5]、彭國平[6]、江曉路[7]也有相似的結論，他們均認為蛹蟲草與冬蟲夏草成分相近。

冬蟲夏草具有很高的藥用價值，但由于生長環境和寄生條件特殊而嚴格，加上近年來采挖過度，天然資源緊張，價格昂貴。因而許多學者致力于蛹蟲草的人工培養，本文目的在于對蛹蟲草固體培養條件進行探索及優化，并以工業液體發酵菌絲體作對比，對在最優條件下培養出的蛹蟲草子實體及采后培養基中蟲草素的含量進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種 蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Fr.)供試菌株4株，編號A、B、C、D，保藏在貴州大學西南藥用生物資源教育部工程研究中心。

1.1.2培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL。搖瓶液體母種培養基：蛋白胨2%，蔗糖 2%，MgSO4·7 H2O 0.05%，KH2PO40.1%，水1000 mL。

米飯培養基營養液：Ⅰ葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，檸檬酸銨1 g，水1000 mL。Ⅱ 蛋白胨12.5 g，甘油5 g，酵母浸膏5 g，20%馬鈴薯提取液1000 mL。米飯培養基：大米25 g，麥麩1.3 g，玉米粉0.4 g，豆粉0.4 g，蠶蛹粉0.4 g，裝入350 mL的透明玻璃罐頭瓶中，分別加入上述營養素液，用耐高溫白色聚丙烯膜封口。

1.2 儀器與試劑

儀器：超凈工作臺SA-1480-Ⅱ，多段編程光照培養箱GXZ型，電熱鼓風干燥箱101-2AB，美國LABALLIANCE超聲波清洗器，美國Scientific systems公司高效液相色譜儀；試劑：甲醇為色譜純，蟲草素標準品購自美國Sigma公司，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1料水比篩選 該試驗設計11個料水比(基質/水=w/v)，分別為：1∶1.0，1∶1.2，1∶1.4，1∶1.6，1∶1.8，1∶2.0，1∶2.2，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0。將上述配比培養基裝入350 mL的罐頭瓶中，121℃高壓滅菌25 min，待用。

1.3.2不同菌株、培養基及不同的接種方式比較 將蛹蟲草4個不同的菌株A，B，C，D活化后，分別制作為孢子懸液(1)、液體種(2)和斜面種(3)，分別將3種母種接種到Ⅰ，Ⅱ米飯培養基上(表1)。

表1 不同菌株、接種方式、培養基的組合Tab.1 Combination of strains， inoculation method and culture medium

注：A， B， C， D代表不同菌株；Ⅰ、Ⅱ代表不同培養基；1、2、3代表不同的接種方式。

1.3.2.1 菌絲培養 接種后移入培養室，溫度控制在23～25℃，空氣相對濕度為65～70%，黑暗培養，15 d左右菌絲封底，此時室內增加散射光，5～7 d后培養料表面或四周有桔黃色色素形成，即進入子實體管理時期。

1.3.2.2 子實體管理 菌絲轉色完成后，為刺激子實體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10 h， 溫度每天18℃，10 h/24℃，14 h交替，相對濕度提高至80%左右，每天通風30 min以補充新鮮空氣，蛹蟲草子座長出后，增加光照強度，溫度保持22℃左右，空氣濕度85%左右，每天通風換氣30 min。

1.3.3蟲草素含量測定

1.3.3.1 色譜分析條件 色譜柱采用Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)反向硅膠柱，流動相：10 mM KH2PO4溶于甲醇/雙蒸水(15∶85)，HPLC測定時流動相流速設定為1 mL/min；檢測波長為254 nm，柱溫30℃，進樣量為20 μL[1]。

1.3.3.2 蟲草素標準曲線的制備 精密稱取蟲草素標準品5 mg，用雙蒸水定容至50 mL，則該溶液濃度為100 μg/mL，再依次稀釋，得到濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的蟲草素標準品溶液，然后采用HPLC測定標準品溶液，流動相流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30℃的色譜條件下，進樣20 μL后測定峰面積，以峰面積-濃度做圖，得回歸方程 C=3.411 92×10-5A-1.284 60， R2=0.999 6。

1.3.3.3 子實體與采后培養基及工業液體發酵蛹蟲草菌絲中蟲草素含量的測定 將成熟的蛹蟲草子實體、采收后的培養基及工業液體發酵菌絲體50℃烘干，用食品粉碎機粉碎，精密稱取粉末各0.2 g，置于具塞試管中，加入雙蒸水10 ml，超聲處理30 min，后在5000 g下離心15 min，最后經0.45 μm濾膜過濾除去固體雜質后用高效液相色譜法檢測其中蟲草素的含量。HPLC測定時流動相流速設定為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30℃，進樣量為20 μL。所有結果均為三個平行樣數值的平均值。

2 結果與分析

2.1 料水比篩選

按各料水比將大米和水裝入罐頭瓶，高壓滅菌后，根據米的軟硬度和透氣性，比較篩選出1∶1.6效果最好，且子實體培養實驗證明，1∶1.6料水比的米飯培養基內部的水分足夠蛹蟲草子實體形成所需，培養過程不必再補充水分。

2.2 不同菌株、培養基及不同的接種方式比較

不同菌株子實體產量如表2，菌株A每瓶子實體產量最高，菌株B次之，菌株 C和菌株D只產生1～2根或無。菌株A培養成功的成熟蛹蟲草子實體如圖1所示。

孢子懸液方式接種的實驗處理菌絲封底時間為14 d，搖瓶液體母種接種的菌絲封底時間為18 d，而固體斜面菌種接種的封底時間為24 d，比孢子懸液方式接種的處理晚10 d。

與II培養基上培養的蛹蟲草相比，I培養基上形成的原基多，子實體高且粗壯。

綜合菌株、接種方式、培養基三個因素，篩選出進行蛹蟲草子實體固體培養出草率和生物轉化率較高，周期短的組合，即菌株A，Ⅰ培養基，孢子懸液接種(即A1Ⅰ組合，其干重產量達到2.72 說g/瓶)。

2.3 蟲草素含量測定

在最優化的培養條件下培養，得到的蛹蟲草子實體、采后培養基與從企業獲得的工業液體發酵蛹蟲草菌絲體一并烘干、粉碎后，用高效液相色譜法測得蛹蟲草子實體的蟲草素含量為10.22 mg/g，采后培養基的蟲草素含量為2.04 mg/g，工業液體發酵菌絲的蟲草素含量為7.06 mg/g。子實體的蟲草素含量是工業液體發酵菌絲中蟲草素含量的1.45倍，是采后培養基中蟲草素含量的5倍，與溫魯等[8]發表的人工栽培采后培養基的蟲草素含量比子實體還要高的結果相反。

表2 不同菌株子實體產量比較Tab.2 Fruiting body yield of different strains

圖1 蛹蟲草菌株A成熟的子實體Fig.1 Mature fruiting bodies of strain A of Cordyceps militaris

3 討 論

蛹蟲草不同菌株在人工米飯培養基上產生子實體的能力差別很大，菌株A是菌株B的1.75倍(達到2.49 g/瓶)，菌株A的產量和文庭池[9]報道的接近，而菌株 C和菌株D幾乎不產子實體。因此規模生產前必須要做產子實體能力的菌株篩選實驗。

孢子懸液中的孢子濃度可達到107/mL，所以孢子懸液接種發菌快，生長周期短，適于生產上應用。

蛹蟲草子實體中蟲草素含量比采后培養基和工業液體發酵菌絲體中蟲草素含量都高，但是子實體產量較少，成本較高。因此，在野生冬蟲夏草、蛹蟲草資源不斷減少的情況下，為更好更有效地開發利用蟲草資源，可以利用殘余的蛹蟲草大米培養基提取蟲草素及其他活性物質[10，11]。

固體培養出的蛹蟲草子實體產量高，但由于所用的罐頭瓶狹細，成熟子實體彎曲，外觀性狀不夠好，固體培養的容器需進一步改善。

相同條件下，蛹蟲草子實體產量具不穩定性，可能與蛹蟲草菌種退化及遺傳性狀相關，具體原因需進一步深入研究。菌種退化是蛹蟲草子實體產業化中較為嚴重的問題，表現為菌種使用一段時間之后毫無征兆的不長子實體、子實體產量或有效成分含量嚴重下降，且菌種退化往往是不可逆的，因此會給蛹蟲草的生產帶來很大的損失[1，12]。目前主要是通過新菌株分離、減少傳代次數、菌株復壯和采用適當的菌種保藏方法來減少菌種退化問題[13，14]。

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