中國乙型腦炎病毒株的毒力變異和減毒活疫苗的研究

俞永新

100050北京,中國食品藥品檢定研究院

自1949年以來，中國學者從自然界分離到數百株乙型腦炎病毒株并對其進行過病毒的生物學特性、致病性、抗原性、毒力變異和疫苗的研究[1-6]，積累了大量的寶貴資料，為闡明乙腦在自然界的流行規律和對乙腦的防控、疫苗研制等提供重要科學數據，其中特別是對自然界乙腦分離株間的神經毒力差異及其機制，以及實驗室內毒株的毒力變異和減毒活疫苗的系統研究，獲得突出的成績，達到國際領先水平。

1 中國乙腦病毒分離株的毒力研究

20世紀50年代，黃禎祥等[7]在北京從乙腦患者、蚊蟲、豬血分離到共53株乙腦病毒，并對這些分離株進行3周齡小鼠的腦內和皮下毒力的比較。結果顯示所有的毒株對小鼠的腦內毒力相差不大，LD50滴度(對數)一般都在7.5～9.0之間，但發現不同來源毒株都存在皮下毒力高低不同的毒株，皮下毒力高者達6.1～8.1 lgLD50，低者只有1.0～3.0 lgLD50。若以腦內和皮下LD50滴度(對數)差值＜3.0(高皮下毒力)計算，則從人體分離的23株中有8株(8/23)、蚊體分離的12株中只有2株(2/12)、從豬體分離的20株中最少只有3株(3/20)。提示自然界確實存在皮下毒力高低不同的乙腦毒株，其中從乙腦死亡病例中分離的高毒力株居多。可能皮下毒力強的病毒容易通過大腦屏障侵入腦內有關。王逸民等[8]進一步研究不同年代不同來源10株病毒的致病性，結果也顯示毒株間存在明顯的皮下毒力差異。毒力高者腦內/皮下的LD50差值僅為1.0～1.5 lg，低者為4.33 lg，毒力高者，空斑形態普遍較大，但不同時期的分離株未見差異。

李河民等[9]比較4株乙腦病毒腦內和皮下致病性，發現病毒的腦內毒力無明顯差別，LD50滴度(對數)為8.0～8.4，但皮下毒力有很大差別，P3和P1株LD50滴度(對數)分別＞5.0和5.17，而47株和廣譚株均＜0.75。黃禎祥等[10]曾對P1株和中山(Nak)株的感染力進行比較，分別以不同途徑接種3周齡小白鼠，結果P1株不同代次腦內感染的LD50滴度(對數)平均為8.6，Nak株平均8.2，二者無明顯差別。但兩株病毒皮下接種感染的結果差別很大，P1株LD50滴度(對數)平均值為7.6，而Nak株平均值滴度＜1.3，表明二者皮下致病力有顯著差別。

近年來，劉欣玉等[11]對國內分離的毒株和以往的分離株共17株進行小鼠(12～14 g)腦內和皮下的毒力比較，結果也發現毒株間腦內毒力無明顯差別，但毒株間皮下毒力差異明顯。毒力低的毒株如HLJ02-144株，其 LD50滴度(對數)僅為4.30；而毒力強的毒株如02-41株，滴度高達7.67，但毒力在兩種基因型間無差別。分析毒株的毒力和毒株來源的關系，可見從患者分離的6株中4株的毒力為高和中等水平，結果與黃禎祥等早期的報告一致。說明人分離株的毒力普遍較強，其原因可能是自然界侵入人腦而致病的病毒一般毒力較強。分離自黑龍江省的毒株共有3株，其毒力均在中等和低水平，其原因可能是由于黑龍江氣溫較低，病毒在蚊體內和動物宿主內的復制周期短，病毒變異機率少有關，還有待進一步研究。

乙腦毒株間的腦內毒力差異雖較少發現，但亦曾有報告。黃禎祥等[12]從三帶喙庫蚊分離到31株乙腦病毒，用3周齡小鼠比較其腦內毒力，發現病毒滴度TCID50/LD50存在差異，有5株毒力低的毒株，其中2株比值為3.17 lg，3株為2.17～3.0 lg；其余26株毒力較高的毒株，其比值＜2.0，表明毒株間腦內毒力亦存在一定差異。

陳伯權等[13]對印尼分離的5株乙腦病毒進行小白鼠的腦內和皮下毒力實驗，發現腦內毒力明顯差異，毒力高者病毒滴度PFU/LD50比值僅為0.83，低者為3.23。將低毒力病毒株進行空斑克隆，在10個空斑中出現4個空斑病毒的PFU/LD50＞5.00，對低毒力的病毒又進行第2次空斑克隆，結果出現3株以6.0 lg PFU病毒接種3周齡小鼠腦內不致死的病毒。

近年在中國臺灣1個小島上從騷擾阿蚊中分離到1株對乳鼠腦內致病力很弱的TIPI株，其LD50為2.44×106PFU較分離自其他地區的CH1 392株毒力(2.87×102PFU)明顯較低。而該島上居民的乙腦抗體陽性率雖然較高(48.8%)，且抗體水平隨年齡增長而升高，但該島多年未發現臨床乙腦病例[14]。分析其原因可能是由于弱毒株不引起臨床表現，但可以產生隱性感染。SA4株其腦內毒力(LD50)雖與其他乙腦毒株相似，但小鼠腦內接種后，病毒在腦內的增殖速度較其他毒株顯著迅速，引起動物發病和死亡的時間更快，呈暴發型，與其他毒株比較死亡時間要提前約24 h，同時腦內病毒滴度的高峰也提前1 d[15].

以上結果表明自然界確實存在腦內和皮下毒力高低的乙腦病毒株，該結果可以解釋人類受感染后有輕重不同臨床表現及顯性和隱性感染的主要原因。

黃禎祥等[16]對神經外毒力差異的機制進行研究，發現毒力高的毒株在小鼠體內產生的病毒血癥持久時間長，如高皮下毒力的P1株，時間長達6 d，而低毒力的M47和Nak株，病毒血癥時間僅為2 d。而且在體外實驗顯示，皮下毒力高的毒株對溫度的穩定性亦較高。將P1和Nak株病毒液置37℃水浴內，Nak株56 h檢測陰性，而P1株置72 h仍可測出1.62 lg病毒。汪瑾等[17]還觀察到不同毒力病毒株在小鼠體內不同臟器如肝、脾、心，腎等的繁殖能力相差很大，如P1株的繁殖力強，臟器內病毒滴度普遍高于Nak株，存在的時間亦較長。病毒侵入腦內的時間早，如以小劑量病毒靜脈注射則各臟器內的病毒量，A2株普遍較高，NaK株則測不出病毒。

黃禎祥[18]將皮下毒力強的京衛研1(A2)在不同鼠齡以不同途徑傳代的毒力變異研究，結果顯示在鼠腦傳代過程中，皮下毒力隨著傳代次數的遞增而下降，降低的速度又與傳代用小鼠的鼠齡密切關系。即鼠齡越大，腦內傳代后皮下毒力下降越快，下降幅度越大。如將A2株在7日齡、3周、5周和1年齡小鼠的腦內傳代時，經7日乳鼠腦內傳代的病毒到145代時，才可見毒力明顯下降，在3周小鼠腦內傳代的病毒，到113代后，皮下毒力已下降到4.5lg LD50，在5周鼠腦內傳代時到113代后皮下毒力已下降至1.0～1.3lg LD50，而在1年鼠腦內傳代的毒力到118代時已失去其皮下毒力。但是如病毒通過小鼠皮下接種傳代，皮下毒力不降低。另外將鼠腦內傳代后皮下毒力降低的變異株，通過同齡小鼠皮下傳代，皮下毒力可以回轉增強。如皮下毒力降低為2.7lg LD50的變異株，通過皮下傳代115代后皮下毒力又增強至7.1lg LD50.

以上結果顯示病毒變異是通過適應過程來實現的，一方面與原來病毒的特性有關，另一面則取決于環境，環境越不同于病毒原來的生存條件，病毒發生變異的時間就越快，幅度越大。

2 中國乙腦減毒活疫苗的研究

20世紀50年代開始，中國病毒學研究人員不斷探索研究乙腦的減毒活疫苗，取得重大的成果，其中1株SA14-14-2株已得到WHO和國際公認，是1株高度減毒安全長效的疫苗株，另一些毒株雖然沒有獲得生產許可證，但在病毒毒力減弱、免疫原性提高技術和規律上積累了豐富的經驗，對乙腦和其他黃病毒減毒活疫苗的研究具有十分有益的參考價值。

2.1 雞胚細胞傳代減毒株

2.1.1 雞胚細胞連續傳代后的毒力變異:李河民等[19]將乙腦P3株在雞胚組織塊細胞37℃培養連續傳代，隨著傳代代次的增加，對小鼠的皮下毒力逐步下降，對10～12 g小鼠已失去致病力，對乳鼠的毒力也降至3.0 1 g。但腦內毒力未見降低，在129代時腦內毒力仍高達4.5～5.5 lg，繼續傳至230代，同時另1組自138代置41℃培養119代共計257代，結果腦內毒力均未見降低。

以后又另選SA4(1952年由汪美先在西安乙腦病例分離株)和Lm株(1956年由俞永新在北京市從乙腦患者腦分離出)在相同的體外雞胚組織塊細胞培養內傳代[20]，結果Lm株在37℃傳至189代。王用楫等[21]用P3株乙腦病毒在雞胚細胞連續傳140代獲得一株C系減毒株，其對7～9 g小白鼠腹腔毒力明顯降低，由第1代的4.8 lg LD50下降至以病毒原液接種時僅個別小鼠發病死亡(≤10%)。腦內的毒力也有一定下降，但不明顯，由第1代的5.8 lg LD50下降至2.5～4.0 lg之間。以C株第24、57、119代活毒免疫小鼠1劑，免后14 d以活毒腹腔攻擊，結果保護指數高達百萬以上，免疫組小鼠僅在攻擊后2或3 d在局部和對側淋巴腺和血液查到病毒而對照組小鼠，則于1～6 d內在淋巴腺、血液、肝、脾和腦等組織廣泛存在病毒。表明該減毒株具有良好的免疫原性。

王用楫等[22]進一步以C株對仔豬進行免疫觀察以1.0和10 ml分別接種6只仔豬，抗體陽轉率分別為2/6和5/6。

2.1.2 雞胚細胞傳代加乳鼠皮下傳代減毒株[23]:上述SA4株雞胚細胞傳代后的皮下毒力完全喪失，腦內毒力僅有一定的下降但免疫原性很差。為提高其免疫性，將SA4雞胚細胞203代病毒在1～3日齡乳鼠皮下傳代，接種病毒后4 d，收取局部皮膚和皮下組織及淋巴結混合研磨后，以10-1懸液接種雞胚細胞培養增殖病毒后，再以同法接種乳鼠皮下，交替傳代至12代后，單在乳鼠皮下連傳3代，共計15代，獲得毒株命名為SA4SM株。對SA4SM株毒力和免疫力進行研究，發現SA4SM株腦內毒力較未經乳鼠皮下傳代的病毒毒力約下降2.0 lg。將SA4SM株做空斑克隆純化，結果，5個空斑中有4個對小鼠的腦內不致病或個別致死，僅1個空斑病毒的毒力為2.0 lg。而未經乳鼠皮下傳代的病毒5個空斑中的腦內毒力高達2.0～4.0 lg。

為考核實驗的可重復性，又將SA4 CEC279代病毒按同法，在乳鼠皮下傳6代。結果從第1代開始各代病毒均較原始株毒力下降1.0～2.0 lg。但有趣的是，雖然第1代和6代病毒的毒力無明顯差別，但經空斑克隆后，則發現在相同病毒感染量的情況下，第6代中，9個空斑病毒普遍較低，LD50在0.61～1.78 lg，而第1代中的7個空斑病毒毒力明顯較高，為2.0～3.37 lg。以上結果提示病毒可以通過乳鼠皮下傳代快速減毒，其機理可能與病毒在非神經組織內的選擇適應，淘汰嗜神經病毒顆粒有關。

為進一步篩選到毒力更低特別是對小鼠腦內無致病性的減毒株，作者又對SA4SM株進行連續6次的空斑篩選，每次選毒力最低的空斑病毒作為代表株進行下一輪純化，結果在前5輪的純化中，數十株空斑病毒的腦內毒力，普遍較低，但病毒原液對小鼠仍有半數死亡或僅死亡1只，未達到對小鼠腦內完全不致病的程度。因此又進行第6次空斑純化，結果8個空斑中只有2個對小鼠死亡1只，其余6個均對小鼠均不致病。為了解這8個空斑的毒力穩定性，進行了小鼠腦內回傳實驗(返祖實驗)，結果一個空斑病毒經腦內傳至第3代毒力仍為0，第4代時略有回升，≥2.5 lg LD50；另一個空斑傳至第4代毒力為0，到第5代，PFU為5.69 lg，LD50仍低至1.0 lg LD50，表明這株病毒不但對小鼠腦內無致病性，而且毒力十分穩定，無返祖現象，達到制備減毒活疫苗的低毒力和遺傳穩定性的穩定水平。

作者進一步對乳鼠皮下傳代后病毒及其克隆株的免疫性進行研究，結果顯示通過乳鼠皮下傳代后的病毒株，免疫原性有極大的提高，免疫保護指數提高萬倍，如傳代前的原始株CEC279代病毒的保護指數為＜10，而SA4SM株為1萬，其空斑純化克隆株的免疫指數亦高達萬至10萬，其中高度減毒株SA4SM-6克隆株的指數為13萬[23]。

以上結果顯示通過乳鼠皮下傳代不但病毒的神經毒力極大下降，而且免疫原性也極大提高，原因應該是病毒提高了在機體皮下和周圍淋巴組織的復制和繁殖能力，促進機體免疫系統對病毒抗原的應答。

2.2 地鼠腎細胞傳代減毒株 以地鼠腎細胞傳代為主并結合其他手段對乙腦病毒進行毒力減弱的減毒株有以下數株。

2.2.1 SA14-14-2株[24-25]

2.2.1.1 減毒歷史:通過不同乙腦病毒分離株的生物學特征、抗原性和免疫原性的研究比較后選用1954年由汪美先分離自西安庫蚊幼蟲的SA14株鼠腦11代病毒作為母株進行減毒，采用地鼠腎細胞連續傳代技術，但不是傳統的低溫(32℃ ～34℃)培養，而采用36℃ ～37℃下培養，經地鼠腎細胞培養傳100代后，病毒對10～12 g幼鼠的腦內毒力由原來的8.0 lg下降至3.7 lg/0.03 ml[26]，經蝕斑克隆后，從9株毒力不同(LD50＜0.0～5.50 lg)的空斑病毒中，選出1株對小鼠腦內注射僅個別發病的弱毒克隆株(12號)，對12號病毒進行空斑2次克隆獲得1株腦內毒力僅對個別小鼠發病的12-1-7株[27]。

但12-1-7株的弱毒很不穩定，經細胞傳數代或小鼠腦內傳1代，毒力迅速回升恢復至接近其母株SA14的毒力水平，以后雖經2次的空斑克隆純化，但仍未能篩選到弱毒穩定不返祖的弱毒株。隨后，進行第二步減毒，采取一種具有一定創新性的手段，即通過動物非神經組織傳代與空斑克隆相結合的技術，將12-1-7株病毒在小鼠腹腔傳一代取脾，空斑克隆4次，再經小鼠皮下傳1次，取皮下組織，空斑克隆1次，獲得1株弱毒高度穩定的毒株，即病毒經3周齡小鼠腦內連續傳5代，或經乳鼠腦內傳1代，鼠腦內的病毒毒力為0的結果，命名為SA14-9-7株[28]。但該株病毒制成活疫苗，經兒童接種后抗體應答很差，在41名兒童中只有1名的中和抗體陽轉，7名由陰性轉為可疑[29]。

為提高SA14-9-7株的免疫性，又將病毒通過動物體內免疫器官(脾臟)傳代的技術。將SA14-9-7株通過口服途經接種地鼠，收脾臟再以同法連續傳6代，最后經空斑克隆2次，獲得1株毒力和弱毒穩定性與SA14-9-7株相同，而免疫原性(小鼠免疫后的保護力和免疫后中和抗體水平)顯著提高的病毒株，命名為SA14-5-3株[29]。

SA14-5-3的人體免疫后抗體應答觀察結果，顯示其免疫性有顯著提高，如山東濟南的結果陽轉率為86.2%(25/29)[29]，在其他乙腦流行區為85% ～92%[30]，但在非乙腦地方病區如浙江象山縣壇頭山島的陽轉率僅為55% ～77.6%[31]，黑龍江齊齊哈爾市僅為62%[32]。表明其免疫性仍有待提高。另外SA14-5-3株在豬體內進行過大量安全性和免疫性觀察表明對豬的免疫是安全的，并有預防豬感染乙腦引起流產和死胎的免疫效果。弱毒株穩定不易返祖如通過乳豬皮下傳5代后，其血清、脾臟和皮下組織內的病毒，對小鼠腦內接種仍無致病性[33]。SA14-5-3株雖然沒有應用于疫苗的生產，但其大量的人體安全性免疫性觀察為以后SA14-14-2株提供臨床應用依據。

為進一步提高SA14-5-3株的免疫性，又采用上述相似的技術，但傳代途經改為前述乳鼠皮下傳代的方法，最后篩選到1株毒力最低，免疫力最高的第14-2號空斑病毒，命名為SA14-14-2作為疫苗制備用候選株[34]。以上從SA14-9-3株開始至SA14-14-2株共計通過14次空斑克隆，從100多個病毒空斑中篩選而獲得，篩選過程中基本根據以下三項指標:1.對2.5周齡小白鼠腦內接種不致病，腦組織病理變化顯著減弱，僅個別神經細胞壞死。2.幼鼠或乳鼠腦內傳代1～3代后，毒力無返強。3.以免疫動物1針后誘生中和抗體(＞10)并對乙腦野毒株共攻擊具有顯著保護力(90%以上)。

乙腦病毒是嗜神經毒力很強的病毒，以10-7很小劑量病毒液腦內接種小鼠或猴就能引起動物發生腦炎死亡，要把乙腦病毒毒力減弱至對以上動物腦內接種不致病其難度極大。20世紀50～60年代美國、日本、前蘇聯曾進行過多年的研究，但均未能達到這種水平，特別是要達到減毒株病毒通過乙腦病毒敏感動物腦內返回傳代，而毒力未回升返祖則更難。SA14-14-2疫苗的成功經驗，是早期采用與傳統(32℃ ～34℃)不同的常溫(37℃)下培養細胞傳代減毒，當弱毒毒力容易恢復返祖時采用與傳統(體外細胞長期傳代)不同的體外細胞培養與體內非神經組織交替傳代減毒的手段，并在毒力減弱而免疫性降低后采用體內免疫組織內傳代增加弱毒繁殖能力提高免疫應答的手段。同時在減毒過程中不斷進行多次的空斑克隆篩選。特別是發現弱毒在體內免疫組織傳代有進一步降低毒力，提高弱毒穩定性的作用，以上SA14-14-2株的減毒成功經驗具有獨特的創新性。

2.2.1.2 SA14-14-2株的表型和基因分子特征[35-36]:病毒對2.5周齡小鼠腦內、皮下、腹腔接種均無致病性，對地鼠、恒河猴腦內接種或裸鼠皮下接種均無致病性。弱毒穩定，經3周齡小鼠腦內傳5代或乳鼠腦內1代，弱毒穩定未返祖[37-38]。

對SA14-14-2弱毒株的基因分析表明，強毒株SA14和減毒株SA14-14-2基因組長度均為10 976個核苷酸，兩者存在57～66個核苷酸差異，導致24～31個氨基酸發生改變。其中以外膜蛋白E區氨基酸突變率最高，有8個氨基酸發生突變，經實驗證實該突變與毒力減弱密切相關[39-40]。以后通過乳鼠腦內傳1～3代后進行傳代前后的病毒全基因序列分析比較，發現E區的E107和E138氨基酸與毒力減弱最為密切，這2個位點氨基酸恢復突變，則神經毒力很快回升[41]。證實SA14-14-2株的遺傳穩定性很高，通過乳鼠腦內傳1代其病毒的基因全序列和弱毒特征未發生回復突變[41]，實驗表明在地鼠腎細胞傳22代的晚代病毒與原始病毒的全長核苷酸僅發生8處變化，導致4處氨基酸改變，但均非回復突變，其核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.30%和99.88%，其中E區8個關鍵氨基酸均未發生突變[42]。另外，將病毒經乙腦病毒主要媒介三帶喙庫蚊和致倦庫蚊口腔感染，病毒在蚊體內復制受限，如經胸腔感染，則病毒雖然復制，但復制能力較SA14母株低，子代病毒對小鼠腦內仍無致病性，E區8個重要氨基酸未發生突變，表明減毒株病毒無通過蚊蟲傳播的能力[43-45]。

對病毒的免疫原性研究發現，SA14-14-2株病毒免疫后的一些動物雖然中和抗體很低或陰性，但對野毒株的攻擊保護很強，與滅活疫苗明顯不同[46]。進一步研究發現，其與SA14-14-2免疫動物后產生很強的細胞免疫應答和非結構蛋白中NS1的免疫作用有關[47-49]。SA14-14-2株疫苗產生較強的T細胞免疫應答，最近也在人體觀察中得到證實[50-51]，并且發現疫苗免疫后產生的T細胞免疫應答對登革熱病毒有交叉反應，提示有可能研發1種對乙腦和登革熱兩種疾病均有效的新一代疫苗[50]。另外SA14-14-2株疫苗免疫小鼠后對當前國內流行的Ⅰ、III型基因病毒均有顯著保護(80% ～100%)[52]。

2.2.1.3 SA14-14-2株臨床安全性和免疫性

SA14-14-2株制備的活疫苗在齊齊哈爾市非乙腦流行區進行小量人體觀察并與SA14-5-3株對比，結果前者的抗體陽轉率為92.3%，后者為61.5%[32]，以后又在張家口市進行觀察，結果抗體陽轉率為100%[53]，證實了SA14-14-2株的高免疫原性，優于SA14-5-3株。疫苗又經50萬的臨床觀察[54]，證明安全有效后，取得生產文號，由成都生物制品研究所正式投產。

上市后的疫苗在國內外進行多次大量的安全性和免疫觀察，表明疫苗十分安全，未發生與疫苗病毒引起的腦炎病例，中和抗體的陽轉率在91% ～95%[55]，保護效果93% ～94.5%[56-57]，持久性在國內觀察結果至少11年[58]，在國外觀察結果至少5年[59]。已得到國際普遍認可，是一種高度安全有效的新一代疫苗。

尼泊爾2004—2014年疫苗大規模應用的10年效果觀察顯示，免疫后10年較免疫前當地乙腦減少3 011例，急性腦炎綜合癥減少9 497例[60]。美國學者對SA14-14-2株疫苗于1995年和2015年間，在亞洲不同國家的16次臨床資料總結進行了綜合回顧，得出的結論是，自1988年以來已在全球發出了7億劑SA14-14-2疫苗，乙腦減毒活疫苗對大范圍年齡人群均有良好的耐受性，并且在八周嬰兒接種也是安全的，根據現在資料，獨立專家(independent expert)們并沒有發現接種乙腦活疫苗后報告的嚴重不良反應與疫苗有關的足夠證據[61]。疫苗在全球大規模應用后沒有發生與疫苗有關的確實證據也得到WHO認可[62-63]。

目前疫苗在國內已納入擴大免疫規劃用制品廣泛應用，2013年由成都生物制品研究所有限責任公司生產的乙腦活疫苗為我國首個疫苗產品通過WHO預認證[64]，在美國適宜衛生科技組織(PATH)和GAVI聯盟的支持下已大量出口到國外應用，目前已有尼泊爾、印度等10多國進口該疫苗[65]，年出口量約5千萬人份。

此外，SA14-14-2株也在中國農業農村部所屬多個生物藥業公司用于制備豬乙型腦炎活疫苗，在國內廣泛應用于預防豬感染乙腦病毒引起的流產、死胎和睪丸炎[66]。

2.2.2 SA14-2-8株[67]:2-8株對乳鼠的腦內致死力平均75%，對3周齡小鼠腦內毒力僅個別發病致死。但2-8株的免疫原性有很大提高，保護指數高達7.33lg，并對豚鼠、家兔、地鼠免疫后產生較高的中和抗體。2-8株經16只的猴體實驗，腦內注射后只有6只發生很低的發燒，病理變化所有猴均有不同程度的炎癥反應，神經細胞壞死雖輕，但4/16-9/16猴在不同部位有病變。疫苗曾接種過8 000名兒童，但抗體陽轉率僅約50%，未繼續進行臨床研究。但2-8株疫苗在馬匹體內進行過安全性的免疫性觀察[68]。皮下或肌內注射465匹馬，未見體溫反應及任何神經系統病狀。中和抗體陽轉率84.9～86.6%，免疫后對馬匹乙腦感染的保護作用，在重流行區進行過觀察，疫苗注射組13 246匹，發病4匹，發病率30.2/10萬；未注射組(對照組)10 081匹，發病32匹，發病率317.4/10萬，保護率為90.49%[68]。

2.2.3 H84SP12和L51P11株:林海祥等[69]用空斑克隆技術，以3周齡小鼠皮下毒力(LD50)高低為篩選指標，直接從SA14株乙腦病毒中。通過3次克隆純化，分離到1株皮下低毒力(LD502.67lg)病毒株，稱L株和1株皮下高毒力(LD50，6.5lg)株，稱H株。2株病毒在小鼠的皮下繁殖力H株顯著高于L株。

將2株病毒分別以快速(18 h)傳代法在地鼠腎細胞培養內連續傳代，結果病毒對幼鼠的皮下毒力，L株下降很快，腦內毒力亦有一定下降，但不夠顯著，與傳代前病毒的毒力比較約下降2.0～3.0lg LD50。為進一步減毒和提高免疫性，將H株84代病毒按上述SA14-5-3株的乳鼠皮下傳代法傳1代(H84S1)，結果病毒的腦內毒力顯示進一步減弱，細胞和LD50的滴度差值為3.5lg，大于傳代前的1.17差值。

用L51代病毒以小鼠腦內低毒力為指標，通過空斑連續純化7次，各次病毒空斑均出現高低不同的空斑病毒。但逐次出現低毒力病毒比例占多數的傾向，最后獲得的弱毒株命名為L51P11。同法將H84S1株通過空斑連續克隆挑選8次，同樣出現隨著空斑次數的增多，低毒力病毒出現的比例增多的傾向，最后在第8次病毒空斑中挑選到一株腦內僅個別小鼠致死的空斑病毒，又經過4次空斑純化后，將該弱毒株命名為H84SP12。2株病毒的免疫性繼續了3次重復實驗比較，實驗均顯示H84SP12株的保護力強于LI51P11株，即前者保護50%小鼠存活的最小免疫劑量小于后者100倍以上。表明H84SP12株雖然腦內毒力與L51P11株相似，但免疫性明顯優于后者，提示預先篩選皮下毒力高，繁殖力強的病毒株，以及再通過乳鼠皮下傳代提高病毒在體內的繁殖力，有助于及時選育到毒力低免疫力強的減毒株，避免在傳統的傳代減毒過程中經常遇到的毒力減弱后免疫性也減弱或丟失的缺陷，有其獨特的創新技術。另外本研究中快速的傳代減毒技術亦具有一定的創新性。

2.2.4 雞5-3株:王用揖等[70]用以上述SA14-5-3減毒株為毒種，經雞胚細胞和地鼠腎細胞交替傳代3次后，在雞胚細胞培養上空斑克隆1次，再經雞胚卵黃囊接種，取胚傳下代，連續傳25代，病毒滴度達6.0lg TCID50。以25代后的雞胚病毒制成凍干疫苗進行馬匹免疫實驗。馬匹于頸部肌內注射2.0 ml疫苗，免疫后1個月內，未見體溫上升亦無不良反應，接種后5～7 d產生病毒血癥，中和抗體陽轉率免后1個月73.6%(強陽轉率)和94.7%(弱陽轉率)。疫苗免疫馬匹后，用乙腦強毒株感染攻擊，結果未免疫馬經強毒株攻擊后出現臨床癥狀和病毒血癥，免疫馬未出現癥狀和病毒血癥，表明雞5-3株具有保護乙腦野毒株感染的保護作用。

2.2.5 SA14-14-2:PCK株[71]:中國食品藥品檢定研究院與美國泛特里軍事醫學研究所WRAIR合作，將乙腦SA14-14-2減毒株早代病毒在原代狗腎細胞(液氮凍存的細胞)連續傳代，病毒滴度在第6代時達高峰(7.0×106lg PFU/ml)。繼續傳至16代滴度未繼續升高，用第7、8、9代病毒分別制成主毒株，生產毒種和疫苗，各代病毒均對2～3周齡ICR小鼠腦內接種無致病性，以生產毒種病毒接種10只恒河猴和SA14母株2只猴對比作神經毒力實驗，每只猴于脊髓和大腦兩側各接種1劑量病毒液或稀釋液，結果生產毒種組和稀釋液組猴均未出現神經癥狀，SA14 2只均出現上下肢麻痹癥狀。病理變化分三級判定，結果生產種猴的病理未出現神經細胞壞死，均為V1級的輕度病變，而SA14乙腦強毒株病毒則出現神經細胞退變和壞死，V2占絕大多數，少數為V1和V3級。

后期WRAIR將毒種轉讓Intercel Biomedical用Vero細胞生產滅活的乙腦疫苗，已經美國批準臨床應用，并已在全球很多國家推廣應用[72]。

2.2.6 SA14-14-2PDK-CD株:王壽貴等[73]將SA14-14-2株第5代毒種適應小獅子狗胎腎原代細胞(PDK)。發現病毒能很快適應PDK細胞，從第4代至11代病毒滴度穩定在7.5～8.0 lg TCID50，并對12-14 g小鼠腦內接種均無致死，通過乳鼠腦回傳一代后對幼鼠的腦內毒力仍很低，在0.5～1.67 lg LD50。表明其毒力高度減弱而且穩定不易返祖。

以SA14-14-2PDK-CD株制備的活疫苗在甘肅省武威市非乙腦流行區進行兒童和成人接種觀察，同時與SA14-14-2 HK株活苗進行比較[74]。結果兩組疫苗接種者均未發現疫苗引起的不良反應。23名接種前抗體陰性兒童接種1針后的抗體陽轉率為92.9%，25名抗體陰性兒童接種SA14-14-2 HK株的95.7%相似。顯示SA14-14-2 PDK-CD株的毒力低穩定而且有良好的免疫原性，具有發展1種以原代狗腎細胞為基質生產的乙腦減毒活疫苗的前景。

3 結語

1949年初期，中國乙腦嚴重流行，年死亡人數高達數萬至10多萬。老一輩科學家包括黃禎祥、汪美先、王逸民、李河民、王用揖、自登云等從自然界分離到數百株乙腦病毒，進行生物學、抗原性、免疫性以及細胞培養特征和毒力變異的研究，發現自然界乙腦毒株間存在毒力的明顯差異，特別是神經外毒力差異更為顯著，并且發現同一病毒株內存在不同毒力的病毒顆粒，通過空斑純化能夠加以分離，經實驗室研究發現毒力強弱與病毒在體內各臟器的復制強度、持續時間和病毒血癥有關。另外通過動物和細胞的培養傳代可以人工誘導病毒的毒力變異。結合乙腦在自然界的流行和傳播規律的研究闡明毒力變異的原因取決于環境的壓力，即與媒介昆蟲、動物宿主和自然環境等因素密切相關。同時也闡明人體乙腦隱性和顯性感染的原因。研究結果為以后中國乙腦的防控以及滅活疫苗和減毒疫苗的研制和實際應用提供重要的科學數據。

在病毒的毒力變異、減毒和減毒活疫苗研究上，中國學者作了大量的研究工作，獲得多株減毒株，已成功制成疫苗應用人體、豬體和馬匹，對我國在人和動物中乙腦流行的控制起到重要作用。雖然一些減毒株未能達到制備人體減毒活疫苗的質量標準，但在病毒的培養特征、變異規律、減毒技術、減毒指標和檢測技術及質量控制上取得值得借鑒的豐富經驗。其中特別是發現病毒通過實驗動物體內的非神經組織傳代，能夠進一步降低病毒的殘余毒力并提高其免疫性，應用該創新性技術成功篩選到1株高度減毒而穩定并保持高免疫性的SA14-14-2株。用其制成的減毒活疫苗，達到國際領先水平，得到WHO的認可，生產的疫苗取得了WHO的預認證，已在國內外廣泛應用。將對全球的乙腦控制，降低死亡和殘疾人數起到重要作用。美國疾病預防控制中心專家們指出[76]，當前有幾種乙腦疫苗可供選擇，特別是乙腦SA14-14-2株疫苗的質量得到WHO認可，已取得WHO預認證，質量可靠，價格合理，同時得到GAVI財政上的支持，因此全球控制乙腦疫苗的時機比以往任何時期更佳。通過國際社會和中國政府的支持與努力，我們有機會拯救和改善數以百萬計兒童的生命和生活。

以上不同減毒株的選育經驗，特別是SA14-14-2株通過獨特的減毒技術，獲得一株病毒毒力高度減弱，遺傳穩定性良好，同時保持高免疫原性的減毒活疫苗株的經驗。將為研發其他蟲媒病毒病的減毒活疫苗提供重要科學依據。

利益沖突無