稀土上轉換材料活體干細胞示蹤技術的研究進展

張慧中 綜述 劉凱 審校

在目前的再生醫學研究中，干細胞移植治療始終是重中之重[1]。為了檢驗治療與療效的相關性，所移植干細胞在宿主體內的位置、活性、數量、停留時間、分化情況及轉歸等，都是至關重要的評判依據[2]。然而，常用的量化檢驗手段多基于取樣后的體外組織學檢測，在喪失實時性、可靠性之余，也無法避免處死實驗動物或者二次組織創傷。為了解決上述問題，Weissleder等[3]提出了分子影像學（Molecular Imaging）的概念。此后，建立無創而精確的活體內細胞示蹤方法，逐漸發展成為干細胞研究領域的一大熱點。分子影像學可理解為以量化示蹤體內特定的細胞或分子為目的的動物活體成像方法，包含兩大要素，即高親和力的探針和可放大信號的圖像采集系統[4]。其中，探針包含報告基因、外源性標記物或顯影劑等，成像系統則包含共聚焦熒光顯微鏡、動物活體成像儀、MRI、CT、超聲等[5]，兩大元素不同的組合各有優勢與不足。為了能最大化探針的高靈敏度和影像學的高時空分辨度，聯合多種成像優勢的多模態示蹤技術備受關注。在基于光學成像探針的選擇上，外源性納米標記物憑借標記方法簡便、無生物自熒光、高信噪比、低光漂白性、低細胞光損害等優勢而廣受青睞[6]，尤其是上轉換納米材料（Upconcersion Nanoparticle，UCNP）[7]和半導體量子點（Quantum Dot，QD）[8]，而 UCNP 因為成分多為稀土，其細胞毒性遠遠小于含有重金屬的QD[9]，故更具優勢。UCNP不僅具備光學探針所需的優良屬性，還是極為理想的影像學造影劑。UCNP的多功能性已在分子靶向結合探測、細胞或器官示蹤發光成像、影像學造影、腫瘤光敏治療等領域得到了廣泛的研究開發，并有望建立分子影像學臨床應用的納米材料平臺[10]，其在干細胞治療的機理探究中也將發揮無可估量的推動作用。

1 稀土上轉換材料的研發和制備

1.1 上轉換發光的概念及發展

上轉換發光（Upconversion Luminescence，UCL）的定義是：連續吸收兩個或多個低能量、波長較長的入射光子并將其轉變成一個高能量、波長較短的發射光子的非線性光學過程[7]。其中所吸收的激發光通常為波長980 nm（組織穿透力極高）的近紅外光（Near Infrared，NIR）[11]。而常用的如綠色熒光蛋白（GFP）、熒光素酶（luciferase）等有機熒光探針的發光原理與之正相反，為高能量光（通常為穿透力較差、對細胞損害較大的紫外光[12]）激發出低能量可見光，稱為下轉換發光（Downconversion Luminescence，DCL）[13]， 又稱為斯托克發光（Stokes Emission）[14]，因而 UCL又被稱作反斯托克發光（Anti-Stokes Emission）[15]。 UCL 的概念最早由 Auzel等[16]基于 Bloembergen[17]的假說所提出并研發，經改良拓展逐步投入到生物、藥物檢測等分子影像學的應用中。

1.2 UCNP的制備

目前，為了制備上轉換材料，稀土元素仍是必不可少的，尤其是鑭系元素 （Ln series）離子，包括釔Y3+、鐿Yb3+、釓Gd3+、鉺 Er3+、鈥 Ho3+、銩 Tm3+等，其相對含量對于材料的上轉換性能、生物安全性等均有決定性影響[18]。常用的稀土上轉換材料是通過在固體晶格（多為氟化物）中摻雜稀土離子得到的。其中上轉換理化特性俱佳的NaYF4是目前應用最廣且最為理想的固體晶格[7]，離子半徑相對最小的Yb3常被用作敏化劑，上轉換特性最為突出的Er3+、Ho3+、Tm3+則常被作為激活劑[18]，通常 書 寫為 NaYF4:Yb3+/Er3+或 NaYF4:Yb3+/Tm3+等[19-20]。在980 nm激發光下，UCNP可發出可見光及波長為800 nm左右的不可見光，其中摻有Er3+的材料所發可見光為綠色，摻有Tm3+的材料則為藍紫色，摻有Ho3+的材料則為紅色。而根據元素的比例等因素，所發光的波長可有大幅區別，從而使熒光成像的收集波長區域的設置更為靈活，因800 nm波長光組織穿透性更佳，故可將其設為收集波長范圍，以提高熒光探測的靈敏度。鑒于稀土上轉換材料粒徑極?。?0～500 nm不等[21]），故統稱作上轉換納米材料（Upconcersion Nanoparticle/Nanophosphor，UCNP）。在不同時間段及不同條件的制備下，UCNP的形態各有不同，近期研究最常見的為六方相（Hexagonal-phase）的UCNP，其上轉換效率最受認可，但亦有研究提出立方相的UCNP具有更強的組織穿透力[22]。為了增加UCNP的親水性和生物相容性，需加一定的表面修飾，常用的包括二氧化硅、半胱氨酸、聚合物（PAA、PEG、PEI）、右旋糖酐、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）等進行外殼包裹[23]。綜上可見，表面修飾的NaYF4:敏化劑/激活劑的六方相UCNP是目前較為經典的材料制備模式，但并不受局限，根據研究需要可使用不同的材料組合賦予相應的功能。目前常用的合成UCNP的方法包括水熱法、熱分解法、液相共沉淀法、微乳液法、溶膠-凝膠法等，對于成品的形狀、粒徑、發光顏色及強度等皆可靈活調控[24]。

2 UCNP示蹤干細胞的應用

2.1 UCNP標記干細胞的方法共識

常用的有機熒光探針如GFP、RFP、EGFP等標記細胞的方式主要為病毒轉染，納米材料如量子點（QD）需要通過脂質體轉染、電穿孔或穿膜肽等方法[25]，操作及耗材成本均較高。而UCNP標記細胞主要通過胞吞作用（Endocytosis）[26]，僅需將UCNP的顆?；鞈乙号c細胞共培養，材料即可隨囊泡包裹進入細胞質。因UCNP是作為細胞內異物存在，故被胞吐后影響細胞示蹤作用是一大問題。Zhao等[27]用transwell實驗證明了14 d內攝取了UCNP的大鼠BMSC無明顯的胞吐現象，Ma等[19]所研究的UCNP可在兔BMSC內停留至少21 d，并提出UCNP從囊泡內溢出進入細胞質內后停留時間可相對更久，可見UCNP有極大的長期標記干細胞的潛力。雖然標記方法簡便，但是共培養時的細胞密度、UCNP相對細胞的濃度、共培養時間和條件、細胞應呈貼壁或懸浮狀態等問題都會對UCNP的攝取效率有所影響，因此所采取的方案也各有不同。Abdul等[28]通過將成分為硅殼修飾的NaYF4:Yb3+/Er3+以100 μg/mL的混懸液濃度分別與貼壁的Wistar大鼠的BMSC及成肌細胞（肌肉前體細胞）共培養24 h。Idris等[29]為了提高UCNP攝取效率、節省初始共培養用量，在細胞懸浮狀態下，將硅殼修飾的 NaYF4:Yb/Er（0～100 μg/mL）與鼠成肌細胞共培養40 min，UCNP攝取效率相對更高。此文獻為僅有的關于UCNP與細胞混懸液共培養的報道，而細胞懸浮狀態的攝取效率與貼壁狀態之間的差異尚無結論。UCNP與干細胞共培養的最適時間也缺乏共識，在0.5～24 h間均有文獻報道[19]，最適標記濃度在50～100 μg/mL左右[27-33]。而對于細胞適應能力較強的腫瘤細胞的標記，濃度與時間相對靈活。Chatterjee等[34]將PEI修飾的NaYF4:Yb3+/Er3+以5 mg/mL的混懸液濃度與腫瘤細胞共培養24 h，并證明對細胞活性無明顯影響。目前尚無關于UCN的標記飽和濃度的研究報道。共培養的環境條件基本均為37℃、5%CO2，標記的細胞基本為70%～80%融合。為了去除未被攝取的UCNP，基本都采用PBS反復沖洗。為了在操作上盡量減少UCNP的團聚現象，超聲振蕩分散最為常用，也有選用0.22 μm膜過濾去除結塊的材料[19]。

2.2 UCNP的生物安全性檢測

作為潛在的臨床轉化的生物應用材料，UCNP的生物安全性需要足夠嚴格完整的檢驗，目前已有大量研究多方面認可了其突出的低細胞毒性、高生物相容性等優勢，而在活體內代謝的規律也有極重要的評估意義。

2.2.1 細胞毒性檢測

目前，針對UCNP對干細胞的細胞毒性檢測，其觀察的材料共培養時間通常為12～48 h，久于所采用的UCNP工作標記時間，所研究的材料濃度梯度范圍基本在0～200 μg/mL。Ma等[19]測得 PAH-PAA 修飾的 NaYF4:Yb/Er以 100～200 μg/mL標記24 h后，兔BMSC活性分別為56%和44%；Li等[30]測得RGD-硅殼修飾的NaYF4:Yb/Tm以100 μg/mL標記48 h后，hBMSC活性仍大于80%，而在30 min持續近紅外光（NIR）照射下，細胞活性與對照組無明顯差異。上述結果的差異較大，可能與結合的修飾分子和細胞來源有一定關系。Abdul等[28]將UCNP分別標記BMSC和成肌細胞，證實對環境更敏感的BMSC的活性受UCNP影響相對更大。Xu等[31]驗證了200 μg/mL的PEG-PEI修飾的NaYGdF4:Yb/Er對人羊水干細胞（Amniotic Fluid Stem Cell，AFSC）的增殖沒有明顯影響。以上研究均在干細胞與UCNP共培養后即刻行CCK8或者MTT實驗，而Zhao等[27]選擇先共培養再換為新鮮培養液24 h后再進行細胞活性測試，所用UCNP為PEI修飾的NaYbF4:Tm/CaF2，測得100 μg/mL孵育24 h后的干細胞活性小于60%。相比之下，UCNP對腫瘤細胞的活性影響明顯更低。Sun等[35]的研究顯示，檸檬酸修飾的NaLuF4:Yb,Tm以1 mg/mL標記48 h后，人口腔表皮樣癌細胞（KB cells）的活性仍大于90%。Ma等[36]用 800 μg/mL的 LaF3:Yb,Tm標記人胃癌細胞 （MGC-803 cells）12 h后，細胞活性仍大于60%?？梢姴煌煞值腢CNP針對不同腫瘤細胞的細胞毒性差異較大。以上細胞活性均隨UCNP濃度增加而下降，但Wei等[37]發現半胱氨酸修飾的UCNP的標記濃度越高，所標記的HeLa細胞活性越高，可能是因為半胱氨酸的高親和力促進了細胞的增殖。

2.2.2 對干細胞多向分化能力的影響

Hsieh等[38]發現量子點（QD）會削弱hBMSC成軟骨的性能，可能是由于QD以被囊泡包裹的形式聚集在細胞核周圍而影響了細胞器的功能。但UCNP對于干細胞分化性能的影響則極小，從而也體現出了相比于QD的優勢。在成軟骨方面，Hu等[32]驗證了以氟磷灰石為晶格基質的UCNP在50 μg/mL的標記濃度下對BMSC成軟骨體內、外誘導均無明顯影響。而成骨方面，Ma等[19]證實了標記濃度大于100 μg/mL的UCNP對兔BMSC的成骨能力有顯著影響，但50 μg/mL的UCNP則無明顯影響。Zhao等[27]等證明BMSC與100 μg/mL濃度的UCNP共培養4 h后仍可正常成骨和成脂分化。Liang等[33]證明了 PEG、PEI修飾的 UCNP在標記濃度為 200 μg/ml時對人羊水干細胞的成骨分化能力沒有顯著影響。

2.2.3 生物分布檢測

對于UCNP在活體內的定位定量檢測，目前有報道的實驗動物均為裸鼠，常用方法為980 nm激發活體熒光成像確定UCNP在各個臟器內的分布，并對各個主要臟器進行利用電感耦合等離子體原子發射光譜法 （ICP-AES）檢測精確含量。Nyk等[39]通過將成分為NaYF4:Yb3+/Tm3+的UCNP尾靜脈注射入Balb C小鼠體內，2 h后通過Maestro成像系統完成了首次活體上轉換成像，可見到UCNP在臟器內的分布，但清晰度有限。Abdul等[28]以10 mg/Kg的濃度（組織中ICP可檢測到的最低濃度）將UCNP混懸液由尾靜脈注射入Wistar大鼠體內，分別于不同時間點取材并利用ICP-AES檢測各個臟器內的UCNP含量。經觀察，注射后大鼠的健康狀態正常，ICP示30 min內UCNP大量集中于肺部，肝臟其次，24 h后各臟器中均急劇減少，7 d后基本通過尿路排盡，顯示良好的生物安全性。Chatterjee等[34]將濃度為10 μg/mL的UCNP尾靜脈注射入Wistar大鼠，得到同樣結果。Wei等[37]通過活體生物成像儀檢測裸鼠全身以及取出的各個臟器，同樣觀察到肺和肝臟的熒光信號最強。UCNP最先積聚于肺部的現象與干細胞治療中在肺部大量集中的現象類似[31，40]。因此，將UCNP標記的干細胞停留在指定位置的效率將是今后研究中需要重視的關鍵問題。

3 UCNP上轉換成像示蹤移植干細胞的研究

3.1 體外標記干細胞成像

為了驗證UCNP標記細胞的作用，Abdul等[28]通過將UCNP以0～100 μg/mL的混懸液濃度分別與Wistar大鼠的BMSC及肌成纖維細胞共培養24 h，然后徹底洗去未被攝入的UCNP，在980 nm激發光的共聚焦熒光顯微鏡下觀察，可見發出綠色熒光的UCNP均勻分布于細胞質及細胞核周圍，基本構成了細胞質的形態。Idris等[29]通過5 h的延時共聚焦熒光顯微鏡拍攝記錄了UCNP標記的成肌細胞在體外低血清含量環境下的遷移，觀察到2.5 h時可見細胞互相靠近，5 h時可見細胞自行排列成直線形軌跡。為了提高上轉換成像質量，Yu等[41]研制了一套激光掃描上轉換發光成像顯微鏡 （Laser scanning up-conversion luminescence microscopy，LSUCLM）。Xiong等[42]首次使用LSUCLM對UCNP標記的腫瘤細胞進行清晰顯影。

3.2 體內上轉換成像示蹤干細胞

為了驗證UCNP在活體內可探測到的深度，Chatterjee等[34]將100 μL的4.4 mg/mL的UCNP皮下注射入裸鼠腹股溝、背部、腹部（深度約10 mm），用980 nm激光器照射，CCD收集成像。剝去皮膚暴露肌肉的實驗組UCNP熒光肉眼清晰可見，強度明顯大于有皮膚未暴露肌肉的對照組，而100 μL的QD僅可在皮膚較透明的足部皮下見到其綠色熒光。Idris等[29]通過25 μg/mL濃度的UCNP標記觀察到成肌細胞注射移植入肌肉創面后3 d內所移植細胞從注射點向遠處擴散，但熒光信號于第7天顯著減少，其原因可能為：①UCNP隨細胞增殖和胞吐而被稀釋；②宿主免疫系統導致細胞凋亡。此外，該研究還通過共聚焦顯微鏡觀察UCNP標記的成肌細胞尾靜脈注射后在大鼠耳部血管的分布，實現了無生物自熒光、高信噪比的單個細胞的活體示蹤。Liang等[33]驗證了PEG修飾的UCNP在Balb C小鼠背部皮下注射后，通過改良的Maestro活體成像系統顯示的熒光信號強度和所注射的細胞量成正比，且可精確到捕捉10個干細胞的信號，而QD、超順磁性氧化鐵顆粒（USPIO）能檢測到的細胞量至少上千個[43]。之后他們還成功地利用UCNP活體示蹤了尾靜脈移植入急性肺損傷模型的羊水干細胞。

4 UCNP結合特定分子的功能對干細胞靶向示蹤應用的啟示

除了熒光成像所嚴格要求的高信噪比、光穩定性、生物安全性等絕對優勢，UCNP尚有一極為關鍵的功能，即可結合任何類型的功能團。最為常用的方法為通過配體交換法[37]、配體氧化法[44]、SiO2包裹法[28]等使原本表面為疏水的巰水基的UCNP表面最終帶有親水的氨基、羧基或巰基，從而獲得了與各類生物分子共價偶聯的能力，并可廣泛運用于靶向相關的生物應用中。針對干細胞，Li等[30]將促軟骨化藥物Kartogenin（KGN）通過光敏籠狀連接物（Photocaged linker）結合于 RGD、硅殼修飾的UCNP，使之被hBMSC攝入，并實現了光敏調控干細胞的分化。光敏的主要原理為：經近紅外光NIR刺激，UCNP釋放紫外光，使光敏連接物產生光裂解，其中的KGN得到釋放并作用于干細胞。此外，UCNP在干細胞的靶向運用方面鮮有報道，但在免疫和腫瘤檢測方面的應用是其向干細胞方向推廣的重要參考。

4.1 結合抗體用于免疫檢測及靶向治療

2000年，UCNP就已經廣泛應用于免疫層析檢測[45]，主要用于食品藥品檢測方面[46-47]，醫學生物方面可檢測人乳頭瘤病毒、hCG、雌二醇等[48]。在免疫細胞組織化學方面，Zijlmans等[49]用結合了親和素和CD44的UCNP成功識別了鼠前列腺特異性抗原及人淋巴細胞。2001年，他們成功開發了UCNP作為DNA芯片的功能，并提出非特異性結合可用封閉劑避免[48]。Nagarajan等[50]驗證了結合了間隙黏連蛋白抗體的UCNP可特異性標記，與BMSC共培養心臟細胞H9c2。Xiang等[51]通過結合了特異性抗原的UCNP靶向識別C57BL/6鼠體內的樹突狀細胞，并實現更高效的疫苗注射。

4.2 腫瘤靶向探針的應用

Chatterjee等[34]將葉酸共價結合于UCNP，與腺癌細胞HT29、卵巢癌細胞OVCAR3（均過表達葉酸受體）共培養24 h，顯示其被細胞攝入明顯多于未結合葉酸的UCNP，證明了此法可特異性標記腫瘤細胞。Xiong等[52]使用結合葉酸的UCNP尾靜脈注射入分別移植了HeLa細胞和MCF-7細胞的裸鼠體內，注射后24 h可見在Hela腫瘤中有大量UCNP熒光信號，而MCF-7腫瘤中則極少，從而驗證了結合葉酸的UCNP可作為過表達葉酸受體的HeLa腫瘤的特異性活體靶向探針。他們還用同樣的方法驗證了UCNP可作為過表達αvβ3整合素受體的人乳腺癌細胞MCF-7的特異性靶向探針[42]。

腫瘤中過表達的分子常有極高的特異性，因而UCNP的研究大量集中于腫瘤靶向診治。但在不同的組織缺損或病理區域中也會有特異性表達的生物標記，若可以提升靶向定位的特異性分子的靈敏度，結合UCNP的攜帶作用及良好的生物相容性，即可為提高干細胞歸巢效率等提供新方法。

5 上轉換成像結合影像學檢測的多模態示蹤系統的應用

UCNP雖有獨特的上轉換成像性能，但其靈敏度和空間分辨率遠不及CT，而CT則缺乏MRI的解剖探測深度?？上驳氖?，UCNP同樣具備理想的影像學造影屬性，可與UCL、MRI、CT結合后成為多模態成像示蹤系統。

5.1 UCNP的MRI造影應用

由于MRI的縱向弛豫T1造影劑Gd-DTPA中的Gd是稀土元素中的一種，具有強磁性，故摻入Gd的UCNP具有T1的MRI造影能力，以Gd2O3為固體晶格的UCNP的顯影信號甚至強于Gd-DTPA[53]。Liu等[54]驗證了結合抗-EGFR抗體的NaGdF4:Yb/Er可靶向識別裸鼠體內的腫瘤并在MRI中顯影。在橫向馳豫T2方面，臨床常用的造影劑Feridex成分為超順磁性氧化鐵顆粒 （USPIO），故結合USPIO即可賦予UCNP橫向馳豫T2的MRI造影能力。Zhou等[55]將結合氧化鐵的UCNP注射入裸鼠的前掌，通過T2信號增強的MRI以及上轉換成像UCL對其淋巴結進行清晰顯影。除了結合SPIO，摻入具鐵磁性的鈷Co2+亦可賦予T2的MRI造影能力。Xia等[56]用摻入Co2+的NaYF4:Yb/Tm作為造影劑經靜脈注射實現了裸鼠的活體T2顯影。綜上所述，利用MRI對于深層解剖結構的精確顯影，結合UCNP光學成像的基本定位，從而對于干細胞在較深組織中的位置可進行更準確的定位定量。因此，結合多種成像方式的多模態成像系統目前備受重視[5]。

5.2 UCNP的CT造影應用

稀土元素本身即具備一定的CT顯影強度，其中Gd同樣較為常用。He等[57]證實了NaGdF4:Yb/Er在裸鼠皮下可經CT顯影。然而，為了使顯影強度增加，即X射線衰減系數增強（X-ray attenuation coefficient），需要增加固體晶格內稀土元素的含量比例，并選擇原子數更高的稀土元素合成固體晶格。Ma等[36]選擇了LaF3作為晶格，其中鑭La3+的含量比例較常用晶格更高，合成的UCNP在肌肉內經CT可清晰區別于周圍軟組織顯影。Sun等[35]則選用NaLuF4作為晶格，其中镥Lu3+是原子量最大的稀土鑭系元素，所制得的UCNP的X射線衰減系數明顯高于常用造影劑碘普羅胺（Iopromide），從裸鼠足部注射，經CT三維重建得到了與上轉換成像一致的腿部淋巴管的形態分布。Xing等[58]選用了BaYbF5作為晶格，驗證了BaYbF5:Er的X射線衰減系數顯著強于常用造影劑碘比醇（Iobitridol）。結合相關的核素，UCNP可成為SPECT/CT的理想造影劑。Kostiv等[59]將125I標記的NaYF4:Yb/Er經尾靜脈注射，通過SPECT/CT成像可觀察到30 min內即在肝臟聚集顯影。

6 關于UCNP在干細胞示蹤方面應用的展望

從材料研發角度來看，所采用的元素在保證UCNP的上轉換發光性能以及影像學造影性能的同時，還需注意其粒徑大小和生物安全性。此外，由于UCNP在液體中的分散性對于其轉染細胞效率有著關鍵作用，故其表面的生物相容性修飾也不可或缺。在標記細胞方面，目前已有的研究對于所采用的標記濃度、方法、時間、條件基本趨于一致，相比于耐受性極強的腫瘤細胞，干細胞的標記濃度和時間均受到一定的局限，從而對于實現更高強度的上轉換熒光成像和影像學顯影形成一定的挑戰。在實驗動物的選擇方面，由于上轉換熒光活體成像儀器大小和普及度的局限，實驗動物局限于體型較小的裸鼠或大鼠，而熒光的穿透深度常受毛發及皮膚厚度的限制，目前已實現可穿透黑色毛發達到2 cm深度的上轉換熒光[22]。UCNP在腫瘤相關的靶向應用已日趨成熟，而干細胞相關的研究則相對欠缺，缺乏標記細胞的各種標準。目前，干細胞治療的確切機制以及靶向歸巢作用，是限制該領域發展的兩大障礙。UCNP的多模態分子影像學的潛能有可能極大地推動該領域的進展。期待能更多地開展UCNP示蹤并靶向引導不同干細胞治療的研究，實現更高效的基礎標準，并明確機制和最終的臨床轉化。