基因組編輯技術應用于作物遺傳改良的進展與挑戰

王福軍，趙開軍

（1中國農業科學院作物科學研究所，北京100081；2廣東省農業科學院水稻研究所，廣州510640）

基因組編輯技術是指可以在基因組水平上對DNA序列進行定點改造的遺傳操作技術，其在基因功能研究和改造、生物醫學和植物遺傳改良等方面都具有重大的應用價值[1-2]?？茖W家自20世紀90年代末就開始探索基因組定點編輯技術，但直到2002年，也僅在小鼠[3]和果蠅[4]等少數模式生物中實現了同源重組介導的基因組定點編輯，且因同源重組的效率很低，限制了其應用前景。進入21世紀后，隨著蛋白質結構與功能研究的新突破和人工核酸內切酶（engineered endonuclease，EEN）技術的出現，將特異識別并結合DNA的蛋白結構域和EEN融合，創造出能夠特異切割DNA序列的核酸酶（sequence-specific nucleases，SSNs），從而可以對基因組特定位點進行高效和精確的靶向編輯[5]。

圖1 SSNs介導的DSBs及其修復途徑Fig. 1 SSNs-induced DSBs and repair pathways

目前，SSNs主要包括鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）[6]、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[7]、成簇的規律間隔的短回文重復序列及其相關系統（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9，CRISPR/Cas9 system）[8]和 CRISPR/Cpf1系統[9]。這些 SSNs的共同特點是都能在基因組特定部位精確切割 DNA雙鏈，造成DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）；而 DSBs能夠極大地提高染色體重組事件發生的概率[10]。DSBs的修復機制在真核生物細胞中高度保守，主要包括同源重組（homology- directed repair，HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）[11]2種修復途徑（圖 1）。當存在同源序列供體DNA時，以HDR方式的修復能夠產生精確的定點替換或插入；而沒有供體 DNA時，細胞則通過NHEJ途徑修復[11]。因NHEJ方式的修復往往不夠精確，在 DNA鏈斷裂位置常會產生少量核酸堿基的插入或缺失（insertion-deletion，InDel），從而導致基因突變[11]。

SSNs自2002年出現以后[12]，就掀起了一股席卷全球的基因組定點編輯研究熱潮[13]。尤其是 2010年出現TALENs和2013年出現CRISPR/Cas9技術后，因它們相對簡單、精確、高效，很快被廣泛應用于醫學、農業、基礎研究等領域[2,14]。因 TALENs和CRISPR/Cas9潛在的巨大應用價值，它們相繼被《科學》雜志評為2012年和2013年的十大科學突破之一。本文將重點綜述基因組編輯技術在作物遺傳改良上的應用進展、提出基因組編輯技術應用于作物改良的一般原則，最后討論該技術應用于作物育種的機遇和挑戰。

1 基因組編輯技術在作物遺傳改良上的應用進展

目前，在作物遺傳改良上應用的基因組編輯技術主要包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統3種類型。其中 CRISPR/Cas系統包括 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1[15]和 CRISPR/C2c2[16]等亞類型，但應用最多的是CRISPR/Cas9，而CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2尚無在作物改良上應用的報道。

上述3類基因組編輯技術均能對植物基因組進行精準的定點敲除、插入和替換，因此，其對于控制作物重要農藝性狀基因的功能鑒定、作物重要性狀的遺傳改良具有巨大的應用潛力。相比傳統的常規育種，基因組編輯技術能直接對目標性狀基因進行修飾，有可能大幅度提高目標性狀聚合的精準度和加快聚合育種進程[17]。而相比傳統的轉基因育種，基因組編輯在靶向修飾特定基因后，能通過自交或雜交剔除外源基因以消除轉基因安全顧慮。因此，自基因組編輯技術成功應用于植物后，對該技術的優化及在作物遺傳改良上的應用已成為世界各國和國際農業生物技術公司投資與研發的重點。目前，基因組編輯技術主要集中應用于作物產量、品質、抗性、育性等4個方面的遺傳改良（表1）。現就技術類型和目標性狀分述如下。

1.1 ZFNs技術及其應用

ZFNs技術被稱為第一代基因組編輯技術。ZFN是一種人工改造而成的核酸內切酶，由鋅指蛋白的DNA結合域和核酸內切酶 FokⅠ的切割結構域組成[49]。其中，DNA結合域通常由3—6個鋅指結構域（Zinc finger domain，ZFD）串聯而成[50]。一個ZFD能特異識別DNA鏈上3個連續的核苷酸堿基，多個ZFD串聯后就能特異識別較長的核苷酸序列。FokⅠ是一種非特異性核酸內切酶，在二聚體狀態時才有內切酶活性[50]。因此，實際應用ZFNs打靶時，需要在靶點的兩側各設計一個ZFN。待2個ZFN結合到結合位點后，2個 FokⅠ相互作用形成二聚體，從而在靶點處切割 DNA，產生 DSBs[6]。2002年，ZFNs首次成功應用于果蠅內源基因的定向突變[12]。迄今為止，ZFNs技術已成功應用于人類干細胞[51]、大鼠[52]、果蠅[53]、斑馬魚[54]、擬南芥[55]、煙草[56]和玉米[18]等生物體的基因組編輯。

在作物改良方面，ZFNs技術迄今僅在玉米性狀改良上有一例報道，即2009年《Science》報道SHUKLA等[18]利用ZFNs技術靶向突變玉米IPK1，獲得低植酸含量的玉米突變體。植酸鹽是谷物飼料的抗營養組分，低植酸鹽含量的谷物飼料能降低來自動物飼養作業所產生廢物流中的磷酸鹽污染。由于ZFNs的構建難度較大，普通分子實驗室難以操作，且成本高，預測其很難廣泛應用于植物基因組編輯。

1.2 TALENs技術及其應用

TALENs是繼ZFNs之后的第二代基因組編輯技術。TALEN結構與ZFN類似，也由DNA結合域和FokⅠ的切割結構域融合而成[57]。TALEN的DNA結合域為天然的或經改造的TAL效應子（TAL effector，TALE）蛋白結構域。天然的TALEs都具有高度統一的結構：即高度保守的N端和C端、中間部分的重復區。不同TALEs之間的差異主要在中間的重復區，其由33—35個氨基酸的重復單元組成，各重復單元除了第12和第13位氨基酸高度可變外，其他都高度保守，而這兩個高度可變的氨基酸組合被稱為重復可變區（repeat-variable diresidue，RVD）[58,60]。2009 年，BOCH等[59]和MOSCOU等[60]相繼破解RVDs與核苷酸堿基之間的識別密碼（即NI或 NS—A，NG—T，NN或NK—G和HD—C），由此打開了人工構建靶向基因組任意位點TALENs的大門。TALEN的工作原理也與ZFN相似，TALE重復區的每個重復單元能特異識別一個特定的核甘酸堿基，多個重復單元串聯后就能特異識別較長的核苷酸序列。實際利用TALENs打靶時，同樣需要在靶點兩側設計一對TALENs。與ZFN相比，TALEN載體的構建相對簡單、成本也更低、普通的分子生物實驗室都能操作；此外，TALEN技術基于重復單元與核苷酸堿基一對一的識別模式，特異性更強，靶向編輯的效率更高[61]。因此，自 2010年TALENs技術出現后[7,57]，便迅速取代ZFNs成為新一代的基因組編輯技術。

表1 基因編輯技術在作物遺傳改良中的應用Table 1 Application of genome editing in crop genetic improvement

TALENs技術應用于作物遺傳改良最早見于水稻。2012年，LI等[19]首次利用 TALENs技術對水稻白葉枯病感病基因Os11N3（SWEET14）啟動子中的效應蛋白結合元件（effector-binding element，EBE）進行定點編輯，有效阻止了水稻白葉枯菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）分泌的效應蛋白（AvrXa7和PthXo3）與Os11N3啟動子結合，使該基因不受Xoo的誘導表達，從而提高了水稻的白葉枯病抗性。隨后，TALENs技術相繼在小麥[23]、大豆[24]和馬鈴薯[25]等主要作物的重要性狀改良上獲得成功。

MLO（MILDEW-RESISTANCE LOCUS）是大麥、小麥等作物中白粉病菌成功侵染所必需的基因，該基因突變后，大麥表現出對白粉病菌的持久、廣譜抗性[62]。2014年，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊利用TALENs技術同時靶向突變小麥MLO的3個拷貝，獲得了3個拷貝都突變的純合突變體，該突變體小麥對白粉病菌表現極為顯著的抗性[23]，證明TALENs技術能對小麥這樣的多倍體植物進行定向遺傳改良。同年，美國Cellectis公司研究人員通過TALENs技術靶向突變大豆脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1A和FAD2-1B，獲得的雙基因突變體中油酸含量由 20%提高到 80%、亞油酸含量由50%降至4%，極大地改善了大豆油的品質[24]；隨后，該公司又通過TALENs技術靶向修飾馬鈴薯的VInv，改良了馬鈴薯的耐冷藏和加工性[25]。此外，SHAN等[20]利用 TALENs技術敲除水稻品種日本睛的OsBADH2，使無香味的稻米產生了香味；MA等[21]利用該技術敲除水稻脂肪氧化酶基因Lox3，改良了水稻種子的耐貯藏性；BLANVILLAIN-BAUFUME等[22]利用該技術對水稻白葉枯病感病基因SWEET14啟動子中效應蛋白AvrXa7和Tal5、TalC的EBEs進行定點編輯，使感病水稻品種的白葉枯病抗性提高到中抗以上水平。

1.3 CRISPR/Cas9技術及其應用

CRISPR/Cas是細菌和古細菌抵御病毒和外源DNA入侵的適應性免疫系統[63]。目前，CRISPR/Cas系統可分為兩大類。第一大類由多個Cas蛋白組成的復合體行使生物學功能，第二大類由單個 Cas蛋白（如 Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2）行使生物學功能[64]。CRISPR/Cas9屬于Ⅱ類，僅需要成熟的 crRNA（CRISPR-derived RNA）、tracrRNA（trans-activating RNA）和Cas9蛋白就能實現對外源DNA的切割[65-66]。經人工改造的 CRISPR/Cas9系統主要由引導 RNA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9蛋白結構域組成。其中，sgRNA起精確定位作用，其 5′端前 20個核苷酸堿基決定Cas9蛋白特異性切割基因組DNA的部位；Cas9蛋白包含類 HNH核酸酶結構域和類RuvC核酸酶結構域，分別負責切割靶DNA互補鏈和非互補鏈 DNA[66-67]。CRISPR/Cas9系統在工作時，sgRNA和Cas9形成一個嵌合蛋白，該嵌合蛋白切割與sgRNA 5′端前20-nt互補的基因組DNA雙鏈，產生DSBs，最后通過HDR或NHEJ修復途徑產生基因突變。2013年，CPISPR/Cas9系統成功實現人類細胞的基因組定向編輯[8,68]，隨后被迅速應用于人類、動物和植物等的基因組編輯[69-70]，并超越TALENs成為第三代基因組編輯技術。

CRISPR/Cas9系統具有構建簡單、編輯效率高、容易實現多基因編輯等優勢，現已成為應用最廣泛的基因組編輯技術，在作物遺傳改良和品種培育上具有重大應用潛力[71]。目前，CRISPR/Cas9技術已成功應用于多種作物如水稻[26-38]、玉米[39-41]、小麥[42]、大豆[43]、番茄[44]、柑桔[45]和蘑菇[46]的重要農藝性狀遺傳改良。

1.3.1 在作物產量和品質改良上的應用 LI等[27]以水稻品種中花11為材料，利用CRISPR/Cas9技術對水稻產量負調控基因Gn1a（每穗實粒數）、DEP1（直立型密穗）、GS3（粒長和粒重）和IPA1（穗粒數、分蘗相關）進行定點修飾，發現Gn1a或DEP1、GS3突變后水稻的每穗實粒數或著粒密度、粒長都明顯增加，但DEP1突變體在著粒密度增加的同時有半矮化現象，而GS3突變體在粒長增加的同時芒也顯著增長。類似地，SHEN等[29]利用CRISPR/Cas9技術對5個粳稻品種的GS3和Gn1a進行定向敲除，構建了5個粳稻背景的gs3和gs3gn1a突變系，所有突變系稻谷粒長相比其野生型都增加，所有gs3gn1a突變系的主穗粒數相比其野生型也都增加，單株產量增幅最高達14%。此外，XU等[30]通過該技術靶向突變水稻GW2（粒寬和粒重）、GW5 （粒寬和粒重）和TGW6（千粒重）基因后發現，gw2gw5tgw6和gw2gw5純合突變系的粒長、粒寬和粒重相比其野生型都顯著增加。WANG等[28]利用CRISPR/Cas9技術對秈稻DEP1進行定點突變發現，獲得的大片段缺失突變體水稻著粒密度增加、植株變矮，產量增加。

直鏈淀粉含量與水稻品質密切相關。MA等[33]利用CRISPR/Cas9技術靶向突變直鏈淀粉合成酶基因OsWaxy，突變體直鏈淀粉含量從 14.6%下降至2.6%，由此獲得了糯性品質。SUN等[34]利用該技術對水稻糖苷水解酶基因BE1和淀粉分支酶Ⅱb基因BEIIb進行定點編輯，BE1突變株相比野生型在粒型、總淀粉含量、直鏈淀粉含量等指標上未有顯著差異，但BEIIb突變株相比野生型粒型顯著變小、總淀粉含量和直鏈淀粉含量顯著增加，后者最高達到25%。

在小麥產量改良上，ZHANG等[42]利用瞬時表達CRISPR/Cas9系統對小麥粒長和粒重負調控基因TaGASR7和直立型密穗基因TaDEP1定點編輯，獲得的TaGASR7純合突變株粒重顯著增加，TaDEP1純合突變株明顯變矮。

在番茄生育期和產量改良上，SOYK等[44]通過CRISPR/Cas9技術對一種感光野生番茄的抗成花基因SP5G進行定向修飾。結果顯示SP5G突變后，番茄開花和成熟時間提前了約2周，且掛果量增加、產量顯著提升。

雙孢菇（Agaricus bisporus）非常容易褐變，從而影響其品質。賓夕法尼亞州立大學伯克分校的楊亦農實驗室利用CRISPR/Cas9技術對雙孢菇的1個多酚氧化酶基因PPO進行定向修飾，獲得的DNA-free突變雙孢菇中多酚氧化酶的活性降低了30%，并具有了抗褐變能力。而抗褐變蘑菇于2016年4月成為第一個豁免美國農業部監管的CRISPR編輯作物[46]。

綜上，利用CRISPR/Cas9技術對控制作物產量、品質相關的負調控基因進行定向修飾，能不同程度地改良作物的產量、品質和株型等，是作物高產優質育種的新途徑。

1.3.2 在作物抗病、抗逆性改良上的應用 稻瘟病是危害水稻最嚴重的病害之一。水稻OsERF922是一個ERF（ethylene responsive factors）類轉錄因子基因，負調控水稻對病瘟病的抗性[72]。中國農業科學院作物科學研究所趙開軍團隊以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術靶向敲除OsERF922，獲得的 T2純合突變系在苗期和分蘗期對稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高[26]。柑桔潰瘍病是柑桔生產上最嚴重的病害之一，CsLOB1是導致柑桔潰瘍病的關鍵感病基因[73]。JIA等[45]利用CRISPR/Cas9技術對CsLOB1的編碼區進行定點編輯，獲得的突變體植株對潰瘍病的抗性顯著增強。

隨著作物輕簡化栽培技術的普及，除草劑在作物生產上的使用日益廣泛，因此培育抗除草劑的作物新品種成為重要的育種目標。乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）是支鏈蛋白質合成通路中的第一個常見酶，ALS中特定氨基酸突變可以提高植物對乙酰乳酸合酶類除草劑的抗性[74]。2015年，美國杜邦先鋒公司通過CRISPR/Cas9技術將玉米ALS2編碼區的第165位脯氨酸突變為絲氨酸，獲得了抗氯磺隆的玉米突變體[40-41]。通過類似的策略，中國農業科學院作物科學研究所夏蘭琴團隊和美國加州大學圣地亞哥分校趙云德團隊合作，將ALS編碼區特定堿基定點替換，導致2個氨基酸（W548L和S627I）變異，獲得了抗磺酰脲類除草劑的水稻[35]。同時，ENDO等[36]也通過類似的方法，獲得了ALS編碼區W548L和S627I位置處堿基定點替換的水稻突變體。此外，中國科學院遺傳與發育生物學研究所的高彩霞團隊和李家洋團隊合作，利用NHEJ修復方式建立了基于CRISPR/Cas9的基因組定點插入及替換系統，并利用該系統獲得了在OsEPSPS基因保守區 2個氨基酸定點替換（T102I和P106S）的雜合突變體，其對草甘膦具有抗性[37]。最近，SHIMATANI等[38]等通過基于 CRISPR/Cas9的Target-AID（target-activation-induced cytidine deaminase）方法，將水稻ALS編碼區的第96位丙氨基酸突變成纈氨酸，獲得了抗磺酰脲類除草劑的水稻突變體。

玉米ARGOS8是一個乙烯響應的負調控因子，在干旱脅迫過表達ARGOS8的玉米比野生型顯著增產[75]。SHI等[39]利用 CRISPR/Cas9 技術，將玉米GOS2啟動子（能賦予中等水平的組成型表達）定點插入ARGOS8的5′-非翻譯區或直接替換ARGOS8的啟動子，獲得ARGOS8表達量顯著增加的突變體。這些突變體在干旱環境下，其最終產量相比野生型玉米顯著提升。這是目前首次報道利用CRISPR/Cas9技術通過調節靶標基因的表達量來改良作物遺傳性狀的案例。

總之，通過CRISPR/Cas9技術定點敲除作物抗性負調控因子基因，或定點修飾抗逆性正調控基因的啟動子以增強基因的表達，或對抗性相關基因編碼區定點替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。

1.3.3 在創制水稻雄不育系上的應用 光溫敏核雄性不育系（P/TGMS）的發現使雜交水稻由三系法向兩系法發展。使用傳統的方法，培育一個新的光溫敏核雄性不育系通常需要幾年甚至十年以上時間，但利用CRISPR/Cas9技術可以大大加快培育水稻雄不育系的進程。2016年，上海交通大學生命科學技術學院張大兵團隊利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯粳稻品種空育131內源基因csa（Carbon Starved Anther），獲得了粳型光敏核雄性不育系[31]。同年 11月，華南農業大學生命科學學院的莊楚雄團隊利用CRISPR/Cas9技術對水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進行特異性編輯，創制了一批溫敏核雄性不育系[32]?？梢?，CRISPR/Cas9技術為水稻兩系不育系的培育提供了一條新的便捷途徑。

1.4 CRISPR/Cpf1技術及其應用

CRISPR/Cpf1隸屬于Ⅱ類type V-A CRISPR系統[9]，是迄今發現最簡單、有效的Ⅱ類CRISPR/Cas系統。CRISPR/Cpf1特異切割 DNA雙鏈的原理與CRISPR/Cas9相似，但其作用機制不同[76]。Cpf1是Cas蛋白的一種，其功能與Cas9類似，目前AsCpf1（Acidaminococcussp. Cpf1）、LbCpf1（Lachnospiraceae bacteriumCpf1）和 FnCpf1（Francisella novicidaCpf1）已被證實具有DNA切割及執行RNA加工的活性[77-79]。Cpf1蛋白由具有識別sgRNA功能的a-REC區域和具有核酸酶功能的 NUC區域構成。a-REC包含 REC1和REC2 2個識別結構域；NUC主要包含RuvC結構域、WED（wedge）結構域、一種推定的核酸酶（Nuc）結構域和PI（PAM-interacting）結構域，其中，Ruv-C和Nuc核酸酶分別負責切割靶DNA的非互補鏈及互補鏈的不同位點，由此產生具粘性末端的 DSBs[79]。不同于SpCas9（Streptococcus pyogenesCas9），Cpf1僅需一個42-nt的crRNA（3′端有23-nt與靶DNA序列互補），就能對靶DNA雙鏈進行切割[76]。另AsCpf1和LbCpf1的PAM識別區堿基為5′-TTTN-3′，FnCpf1的 PAM 識別區堿基為 5′-TTN-3′，不同于 SpCas9的5′-NGG-3′[80]。此外，Cpf1 與 SpCas9 切割機制也不一樣，SpCas9切割靶DNA互補鏈的4位和非互補鏈的16位，形成一個平末端；而Cpf1切割靶DNA互補鏈的23位和非互補鏈的18位，形成一個5-nt的粘性末端[76]。但最新的研究結果表明，Cpf1并非只切割靶DNA非互補鏈的 18位，而是在非互補鏈的 14—18位間多個位點切割。當 spacer序列長度≥20-nt時，Cpf1傾向于切割互補鏈的18位；當spacer序列長度＜20-nt時，Cpf1傾向于切割互補鏈的14位[81]。此外，研究人員還證明Cpf1核酸酶在人類細胞中與SpCas9具有相當的切割效率，也證實Cpf1核酸酶在人類細胞中具有高度的特異性[82-83]。

目前，CRISPR/Cpf1技術已成功應用于煙草[77]、大豆[84]和水稻[47-48,77,85-86]的基因組編輯。2016年，ENDO等[77]首次將CRISPR/Cpf1系統成功移植于煙草和水稻的基因組編輯，他們將FnCpf1和crRNA融合開發了 Cpf1-crRNA系統，在煙草和水稻中的編輯效率最高可達 90%。隨后，XU等[47]將 LpCpf1分別與pre-crRNA和加長pre-crRNA融合構建了crRNA- Cpf1系統，在水稻中的編輯效率最高可達41.2%；HU等[86]也將LpCpf1和crRNA整合開發了CRISPR-Cpf1系統，并利用該系統成功實現水稻內源基因的定點編輯；KIM 等[84]開發了 Cpf1–RNP（ribonucleoprotein）系統，并成功利用該系統對大豆和煙草的內源基因進行定點突變。此外，BEGEMANN等[48]將Cpf1、crRNA和供體片段構成融合表達載體，對水稻葉綠素a加氧酶基因OsCAO1進行定點編輯，獲得了在靶點產生的預期InDel突變和片段插入，此外純合突變植株整株都產生黃化現象。TANG等[85]針對Cpf1蛋白及crRNA的表達特性，構建了PolⅡ型啟動子融合核酶（ribozyme）驅動的 Cpf1和crRNA植物表達單元，并成功對水稻內源基因OsPDS、OsDEP1和OsROC5進行定點突變。WANG等[87]將4個DR (direct repeats)-guide單元組成的 crRNA分別與 FnCpf1和 LbCpf1融合構建CRISPR/Cpf1系統，并利用該系統簡單、高效地實現了水稻多基因定點編輯。

CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas9一樣，都是目前最為簡捷、高效和最易實現多基因編輯的基因組編輯技術。兩者表達載體的構建都相當簡單，且都只需要串聯多個crRNA即可實現多位點編輯，而編輯效率和特異性也都相當，另因都受PAM識別位點的限制，編輯范圍也都有一定的局限性。因此，CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas9可以說是不相伯仲的基因組編輯技術，相當于CRISPR/Cas技術“廚房”兩把效果一樣但又能互補的“剪刀”，作為“廚師”的我們，只要能達到我們的目標，選擇任一“剪刀”都可。

1.5 利用CRISPR/Cas系統在基因組編輯方式上的技術創新

1.5.1 植物基因組單堿基編輯系統創新和應用 單堿基突變可引起作物許多農藝性狀的改變，因此，實施單堿基編輯對作物遺傳改良具有十分重要的意義。2016年5月，《Nature》報道了KOMOR等[88]將大鼠胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1，一種堿基修飾酶能改變DNA序列）、Cas9變體（D10A）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）融合構建了大鼠基因組單堿基編輯系統，并用該系統成功糾正了小鼠細胞中阿爾茨海默病相關的突變，單堿基替換效率高達75%。隨后，有 4個研究團隊將該系統成功改造并用于糧食和蔬菜作物（水稻、小麥、玉米、番茄）的基因組單堿基編輯[38,89-91]。

2016年12月，中國科學院上海生命科學研究院朱健康團隊[89]，以及夏蘭琴和趙云德合作團隊[90]同時在《Molecular Plant》上發表了其在植物基因組單堿基編輯上取得的最新成果。朱健康團隊將APOBEC1通過非結構化的16殘基肽XTEN作為接頭，融合到 Cas9（D10A）的 N末端，并將核定位信號（NLS）肽添加到Cas9（D10A）的C末端，構建了APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A）植物基因組單堿基編輯系統[89]。利用該系統對水稻NRT1.1B和SLR1進行編輯，結果表明該系統能在靶位點產生預期的C→T（G→A）堿基替換，NRT1.1B和SLR1在靶位點產生預期突變的效率分別為2.7%和13.3%。夏蘭琴和趙云德合作團隊也利用 APOBEC1、Cas9變體（nCas9-D10A）和 UGI的融合基因 BE3[88]構建了植物基因組單堿基編輯系統 pCXUN-BE3[90]。利用pCXUN-BE3系統編輯水稻八氫番茄紅素脫氫酶基因OsPDS和淀粉分支酶Ⅱb基因OsSBEIIb，獲得在3個靶位點產生預期突變（靶序列5′端4—8位置有G→A或C→T）的水稻植株，效率最高可達20%[90]。

2017年2月，《Nature Biotechnology》雜志報道了高彩霞實驗室在水稻、小麥和玉米基因組中實現高效、精確的單堿基編輯的成果。他們同樣利用APOBEC1、nCas9-D10A和UGI，構建了植物基因組單堿基編輯系統nCas9-PBE。利用該系統對3種作物5個內源基因7個靶位點的定點突變結果顯示，在靶序列5′端3—9位置能產生預期的C→T的替換，其中，單個C的替換效率為0.39%—7.07%，多個C的替換效率高達12.48%；而遺傳轉化的結果表明，該系統在小麥、水稻和玉米中獲得靶區域單堿基替換的效率最高可達 43.48%[91]。同年 3月，SHIMATANI等[38]在《Nature Biotechnology》雜志發表了其在水稻和番茄中實現高效的單堿基編輯的最新成果。將nCas9-D10A（nCas9）、PmCDA1（Petromyzon marinuscytidine deaminase）和 sgRNA融合構建了植物基因組單堿基編輯系統nCas9-PmCDA1，并利用該系統對水稻ALS和FTIP1e以及番茄DELLA和ETR1進行定點突變。結果表明，在水稻中該系統在靶區域誘導單個或多個預期單堿基替換（C→T）的效率最高可達50%，在番茄中最高可達80%。

1.5.2 DNA-free植物基因組編輯系統創新和應用

生物安全問題是限制轉基因作物商業化的主要因素。雖然 CRISPR/Cas對基因進行定點修飾后能通過自交后代分離剔除外源 DNA，獲得無外源 DNA基因（DNA-free）的編輯植株。但目前只有美國對CRISPR編輯作物安全實行監管豁免[92]，其他國家都還處于觀望狀態。因此，建立全程 DNA-free的植物基因組編輯系統對于推動基因編輯作物的商業化利用具有重要意義。目前，DNA-free植物基因組編輯系統主要有瞬時表達 CRISPR/Cas9編輯系統[42]和 RGEN（RNA-guided engineered nuclease）核糖核蛋白（RGEN ribonucleoproteins，RGEN RNPs）編輯系統[93]。

瞬時表達CRISPR/Cas9編輯系統的操作流程和原理是：將CRISPR/Cas9質粒DNA（TECCDNA）或其轉錄的RNA（TECCRNA）通過基因槍法直接轉入植物愈傷組織，因是環狀質粒或RNA，故不易被整合進植物基因組中；在完成切割使命后，質粒DNA或RNA會被細胞內源核酸酶分解，從而實現全程 DNA-free的基因組編輯[42]。研究人員對該系統在小麥基因組中的定向修飾特性進行了詳細的研究。通過對4個小麥品種的7個內源基因（共9個靶位點）靶向修飾發現，TECCDNA在小麥T0轉基因植株中誘導突變的效率為1.0%—9.5%，DNA-free突變植株的比例為 43.8%—86.8%。對比分析顯示，TECCDNA和經典 CRISPR/Cas9系統的定向編輯效率和脫靶效應上沒有明顯差別，但都顯著高于TECCRNA[42]。

RGEN RNPs技術是將CRISPR-Cas蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復合體，該復合體進入細胞后能迅速行使 DNA切割功能，然后被細胞內源蛋白酶快速分解，從而實現全程無外源 DNA整合的基因組編輯[94-95]。RGEN RNPs技術最先應用于低等動物[76]和人類細胞[77]，隨后被應用于擬南芥[93]、煙草[93]、萵苣[93]、水稻[93]、矮牽?；╗96]、玉米[41]、小麥[97]和大豆[84]的基因組編輯。

2015年，WOO等[93]首先將RGEN RNPs技術成功用于植物的基因組編輯。研究表明，RGEN RNPs在擬南芥、煙草和水稻的原生質體中定向編輯的效率分別為 16%—19%、17%—44%和 8.4%—23%，在轉化萵苣的再生植株中定向編輯的效率為 45.7%，且沒有檢測到脫靶突變[93]。此外，SUBBURAJ等[96]通過RGEN RNPs技術對矮牽?；▋仍椿騊hNR（nitratereductase）的 6個位點（NR1-6）進行定向修飾，發現在原生質體中RGEN RNPs誘導定點突變的平均效率為（11.5±2）%。顯然，這兩項研究只聚焦在植物原生質體層面的基因組定向修飾，還未真正涉及作物的遺傳改良。

2016年11月，《Nature Communications》報道了美國杜邦先鋒公司利用RGEN RNPs技術獲得了無葉舌、雄性不育和抗氯磺隆的玉米改良系，標志著RGEN RNPs技術在主要作物遺傳改良上的真正應用[41]。研究人員通過基因槍法將組裝好的RGEN RNPs，及RGEN RNPs和同源供體片段轉入玉米愈傷組織，通過NHEJ途徑實現對玉米無葉舌基因（LIG）、雄性育性基因（Ms26和Ms45）進行定點突變，通過 HDR途徑實現對ALS2基因定點替換（編碼區的第165位脯氨酸突變為絲氨酸），最終獲得了全程無外源 DNA作為載體的 DNA-free基因編輯玉米，表現為無葉舌、雄性不育和抗氯磺隆[41]；對比分析發現，RGEN RNPs和Cas9-gRNA質粒（即TECCDNA）定向編輯效率基本一致，但 RGEN RNPs誘導的脫靶效應顯著低于Cas9-gRNA質粒誘導的[41]。類似地，LIANG[97]等利用RGEN RNPs技術對小麥TaGW2進行定向編輯，深度測序結果表明 CRISPR/Cas9 RNP定向編輯的效率較CRISPR/Cas9 DNA要低，脫靶的機率也更低，且在突變植株中未檢測到脫靶現象。

上述報道都是基于 CRISPR/Cas9 RNP的 DNA-free植物基因組編輯。2017年，KIM 等[84]首次利用CRISPR/Cpf1 RNP成功對大豆FAD2和煙草AOC實現定點編輯，效率最高達 11.7%，且在大豆基因組潛在脫靶位點未檢測到顯著突變。

2 基因組編輯技術應用于作物改良的基本原則

2.1 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas如何抉擇

ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術，但三者在設計、特異性和效率上各有不同。ZFNs由于特異性不高、脫靶問題嚴重及獲得ZFN蛋白非常困難，嚴重阻礙了其廣泛應用。TALENs的優點是特異高、脫靶效應低，但載體構建較繁瑣[98]、編輯效率不是很高、且難以同時對多個基因進行編輯[23,99-100]。CRISPR/Cas系統的優點是編輯效率非常高[33,101]，設計和構建極其簡單（只需2—3 d），僅需設計、合成靶點識別序列，且也只需將 sgRNA串聯就能實現多基因編輯[102]；但CRISPR/Cas系統的特異性稍差，存在較明顯的脫靶效應[103-105]，另受PAM識別位點限制。目前，ZFNs已基本被 TALENs和 CRISPR/Cas系統所取代，而TALENs在植物基因組編輯中也已逐漸失去優勢。因此，在作物遺傳改良上，優先推薦使用 CRISPR/Cas系統，如 CRISPR/Cas系統無合適的靶位點或對特異性要求極高的情況下可使用TALENs技術。

2.2 基因敲除還是基因替換

目前，基因編輯技術應用于作物遺傳改良主要有兩種方式，一是通過靶向敲除目標性狀負調控基因，造成該基因功能缺失，以改良目標性狀；二是通過對目標性狀控制基因進行定點替換，導致該基因功能發生改變，從而獲得新的目標性狀。因此，在實踐中運用基因組編輯技術對作物進行遺傳改良時也要分以下2種情況：一是對于目標性狀起負調控作用的基因采取基因敲除的方式，目前，絕大部分基于基因組編輯技術的作物遺傳改良都是通過此方式實現的，如 WANG等[26]對水稻稻瘟病抗性的改良，ZHOU等[32]創制水稻溫敏核雄性不育系等；二是對于目標性狀的獲得是因目標基因突變導致基因功能發生改變的基因，采用基因定點替換的方式，如抗除草劑水稻、玉米等都是通過基因定點替換而獲得的[35-38, 41]。

2.3 靶位點如何選擇

目前，已有多個專門設計SSNs靶位點和搜索脫靶位點的網站和工具[106]。而在作物遺傳改良的實際操作中，是敲除多基因還是單基因、靶位點在基因上的位置及數目都是需要考慮的。如果需要同時改良多個目標性狀，以及目標性狀是由微效多基因或多等位基因控制的情況，最好針對每個目標性狀控制基因，或微效多基因等設計多個靶位點進行定向敲除，能最快、最省地獲得改良目標性狀；而如果控制目標性狀的是主效基因，則敲除單個基因一般即可達到改良目的。

靶位點在基因上的位置也比較重要，進行基因敲除時，靶位點應優先選擇在起始密碼子附近，或在特定的功能域（可能引起密碼子缺失和移碼）；而如果是基因替換，靶位點則需選擇在基因特定功能區（突變后基因功能發生改變的區域）。

此外，靶位點的數量也關系到定向編輯的效率和遺傳轉化的規模，筆者在試驗中發現，敲除同一個基因時分別設計1個、2個和3個靶點進行修飾，突變的效率分別為42%、70%（2個靶點都突變的為63.3%）和90%（3個靶點都突變），獲得純合突變株的效率分別為14.3%、47.6%和40.7%[26]。因此，在基因敲除時，建議單個基因設計2個靶位點，能減輕遺傳轉化的工作量，也能更省、更快地獲得純合突變植株，極大地節省人力和物力。

2.4 如何快速獲得純合的DNA-free編輯植株

目前，獲得純合的DNA-free編輯植株主要有2種途徑：一是通過經典的 TALENs和 CRISPR/Cas9技術獲得基因得以修飾的植株后，通過自交或雜交的方式剔除外源基因；二是直接利用DNA-free植物基因組編輯系統對植物基因組進行定向編輯。2種途徑都有各自的優缺點，通過自交或雜交剔除的途徑相對來說操作簡單、成本低，普通的分子實驗室都能操作完成，且最快能在T1代獲得純合的DNA-free編輯植株[20,26]。DNA-free植物基因組編輯系統的優勢在于能得到全程無外源DNA整合的編輯植株，且在T0代即可獲得純合的DNA-free編輯植株[41-42]，但相對經典的CRISPR/Cas9系統操作較復雜、成本更高。因此，想要最快獲得純合的 DNA-free編輯植株，有條件的實驗室優先推薦使用RGEN RNPs編輯系統，其次推薦瞬時表達 CRISPR/Cas9編輯系統中的 TECCRNA方式，而TECCDNA方式因質粒DNA被細胞內源核酸酶分解后的小片段 DNA有時會插入靶位點和非靶位點處，如果插入的 DNA片段過小，目前的檢測手段還不能對其進行有效鑒定，故不推薦；沒有條件利用DNA-free植物基因組編輯系統的情況下，則使用經典的CRISPR/Cas系統。

3 基因組編輯技術在作物遺傳改良上應用的機遇與挑戰

作物轉基因育種的歷史已有20多年，很多轉基因作物如棉花、大豆、玉米等已在多個國家種植，但轉基因生物（genetically modified organism，GMO）的生物安全性問題一直備受關注?；蚓庉嫾夹g的出現為作物分子育種提供了新的機遇，但仍然面臨政策法規和技術優化兩方面的挑戰。目前，國際上對基因編輯作物是否屬于轉基因生物尚未有明確一致的定論，其監管標準也存在較大爭議。美國農業監管部門認為基因編輯作物（genome edited crop，GEC）是通過細胞自我修復機制而產生的突變體，與作物自然突變以及物理和化學誘導突變極其相似，都是少數幾個核苷酸的改變，因此，GEC不被定義為GMO[107]。歐盟對GMO監管較為嚴格，其認為只要有外源DNA轉入，而不論最終植物中是否還存在外源DNA，都被定義為GMO。從科學角度來講，基因編輯誘導的突變與自然突變以及物理和化學誘導突變性質一樣，實質無法區分，因此歐盟也有建議將GEC定義為非GMO。但基于政治考慮，歐盟尚未下明確定論，對GEC的監管標準存在不確定性[108]。目前，中國對于基因編輯作物的監管標準尚無明確的規定，因此亟需出臺相關的政策法規以正確引導基因編輯育種。迄今，美國農業監管部門至少已認定 5種基因編輯作物新品種不屬于GMO范疇，即通過ZFNs技術創制的低植酸玉米品種，通過TALEN技術創制的耐冷藏馬鈴薯品種和高油酸、低亞油酸大豆，以及通過CRISPR/Cas9技術創制的抗褐化雙孢菇和抗除草劑玉米。

為正確引導基因編輯技術應用于作物育種，中國科學院的李家洋院士等針對基因編輯作物提出了一個監管框架，并發表在《Nature Genetics》雜志。文章對基因編輯作物的監管提出了幾點建議[109]：一是在研究階段應盡量減少GEC不受控的傳播風險；二是要確保GEC中外源 DNA被完全剔除；三是準確記錄靶點DNA的變化，如果通過同源同組引入了新的序列，必須注明供體和受體之間的親緣關系；四是基于參考基因組信息和全基因組測序技術檢測并確定主要靶點沒有意外的二次編輯事件和考慮潛在脫靶事件的后果；五是將上述四點信息在新品種資料中登記備案，除上述四點外，GEC只需執行常規作物品種的監管標準即可。同期，該雜志編輯部發文支持GEC管理框架的建議，并倡導GEC品種在完成透明的原則下，不需要進一步的監管，及與傳統品種進行區分[110]。

基因組編輯技術從出現至今不過短短十多年時間，但其已廣泛應用于生物醫學和農業等領域。特別是TALENs和CRISPR/Cas9技術出現后，極大地加快了作物分子育種的研究步伐。目前，CRISPR/Cas技術已成為基因編輯應用的首選，雖然發明至今不到5年時間，但已被廣泛應用于生物和農業的各個領域，而其本身也歷經了多次技術優化。例如，利用Cas9變體將脫靶率降低到檢測不到的水平[111-112]，對Cas9和Cpf1蛋白進行定點突變擴大了PAM位點的選擇范圍[113-114]，基于CRISPR/Cas9的植物基因組單堿基編輯系統[89-91]，基于CRISPR/Cas9的植物基因組定點插入和替換系統[35-41,115]，以及DNA-free植物基因組編輯系統[41-42]等。

目前，基因編輯技術應用于作物遺傳改良，主要是通過定點突變靶標基因，造成基因功能缺失（lossof-function）以實現性狀改良，故敲除的基因必須都是目標性狀負調控基因。但作物許多性狀改良都需要獲得基因功能（gain-of-function），因此，基因組定點替換或插入的基因組編輯具有更廣泛的應用前景，而植物細胞中同源重組效率很低，目前植物基因組編輯技術對基因單堿基替換、片段定點插入和替換等編輯的效率還很低。如目前已報道的植物單堿基定點替換技術在水稻、小麥和玉米中的編輯效率為0.39%—20%（大都低于10%），且只能是C→T（G→A）堿基替換[89-91]；而已報道的植物基因組定點插入和替換技術在水稻、玉米和擬南芥中的編輯效率也極低，片段定點替換效率普遍低于1%[35-37,40]。因此，對大部分控制重要農藝性狀的正調控基因目前還無法高效、精準地進行編輯，從而極大地限制了基因編輯技術大規模應用于作物遺傳改良的步伐。

雖然目前基因組編輯技術應用于作物遺傳改良還存在政策法規和技術優化兩方面的挑戰，但在植物基因功能研究和作物遺傳改良上其更具有其他分子技術無法比擬的巨大優勢和機遇。放眼未來，我們預計GEC品種監管的法規肯定會寬松；實現基因定點替換和插入的基因組編輯技術一定會得到優化。隨著大量作物品種全基因組測序的完成和越來越多重要農藝性狀不利基因被發現，基因組編輯技術必將在作物遺傳改良和品種培育上發揮巨大的作用。

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