基于有機酸高效液相色譜的葡萄酒品質分析

于 靜 孫婭娜 孫翔宇,3 馬婷婷,4 吳 穎 黃衛東

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院， 北京 100083； 2.北京市產品質量監督檢驗院， 北京 101300；3.西北農林科技大學葡萄酒學院， 陜西楊凌 712100； 4.西北農林科技大學食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100)

引言

葡萄酒中均含酸味物質，即有機酸。有機酸是一類含有羧基的化學物質，通常在葡萄果實生長過程中積累，經釀造過程轉移至葡萄酒中，其對葡萄酒的味感、穩定性的形成和陳釀特性具有重要作用。葡萄與葡萄酒中的有機酸主要包括酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等。適量的有機酸是構成葡萄酒口感特征的要素[1-2]。有機酸的種類、濃度與葡萄酒的類型和品質有很大關系，調節著酸堿的平衡，影響葡萄酒的口感、色澤及生物穩定性。葡萄酒中每種酸各有特點和功效，在葡萄酒中發揮著不同的作用。除此之外，大量研究表明，有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質過氧化物生成等生理功能[1,3]。因此，有機酸的定量測定在葡萄酒品質鑒定中占有重要地位，已經越來越受到人們的關注[4-5]。

葡萄酒具有很強的自然屬性，其品質與葡萄原料種植地區的生態環境、釀造工藝等有密切的關系，其中品種是葡萄酒品質最重要的決定因素之一，不同品種釀制的葡萄酒均具有其獨特的品種風格[4-8]。在我國，單品種葡萄酒已經成為我國葡萄酒發展的重要特色。同時，年份也是葡萄酒品質最重要的決定因素之一，其主要原因在于葡萄酒生產年份的生態環境條件，尤其是氣候條件難以人為控制[9]。國內外對于采用化學成分分析的方法鑒別葡萄酒已有較多的研究[5,10]，研究表明，不同品種、不同年份葡萄酒中許多物質含量有明顯差異。

目前，對于葡萄酒中有機酸的檢測有大量的報道，生物傳感器技術[11]、Langmuir-Blodgget (LB)膜技術[12]、在線電滲析矩陣-液相技術[13]、傅里葉變換紅外光譜[14]、近紅外光譜[15]、電子舌[16]、毛細管電泳[17-19]、質譜[20]、液質聯用技術[21]等均可應用于葡萄酒中有機酸的測定，然而，由于儀器普及率廣，性價比較高，高效液相色譜技術仍然是使用最廣泛的葡萄酒有機酸檢測技術[1,4-5,8-9,22-26]。草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸是葡萄酒中含量最高，對葡萄酒品質貢獻最大的7種有機酸[1, 4, 8-9]。因此，本文首先建立檢測葡萄酒中該7種有機酸的HPLC方法。之后對品種葡萄酒、年份葡萄酒，以及市場葡萄酒(以北京市場為例)中的有機酸含量狀況進行分析，以期為我國葡萄酒產業的發展提供參考，并為客觀評價我國市售葡萄酒質量提供可靠的數據。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設備

年份葡萄酒樣品：由北京市某酒莊提供，包含紅葡萄酒(赤霞珠，Cabernet Sauvignon)2002、2003、2004、2005、2006、2007、2008、2009、2010、2011年共10個年份樣品，以及白葡萄酒(霞多麗，Chardonnay)2003、2004、2005、2007、2008、2009、2011年共7個年份樣品。所有原料均來自同一葡萄園，且釀造工藝均相近。

品種葡萄酒樣品：5個單品種紅葡萄酒，包含赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龍珠(Cabernet Gernischt)、黑比諾(Pinot Noir)、小味爾多(Petit Verdot)、馬瑟蘭(Marselan)，以及6個單品種白葡萄酒，包含霞多麗(Chardonnay)、貴人香(Italian Riesling)、白玉霓(Ugni Blanc)、維歐尼(Viognier)、雷司令(Riesling)、龍眼(Longyan)，均為中國農業大學葡萄酒科技發展中心于2013年釀造，原料均來自我國懷涿盆地某葡萄園，紅、白葡萄酒各使用相近工藝釀造。

市場葡萄酒樣品：購自北京某大型超市，樣品包含5家北京本地生產商A(9個干紅樣品)、B(3個干紅樣品)、C(9個干紅樣品)、D(10個干紅樣品)、E(18個干紅樣品)； 4個國內其他產區：通化產區(5個干紅樣品)、沙城產區(4干紅樣品)、煙臺產區(16干紅樣品)、天津產區(2干紅樣品)；以及進口紅葡萄酒樣品(21個干紅樣品)。對于白葡萄酒，隨機采集了6種樣品進行調查。此外，研究中采用蘇格蘭威士忌和中國勁酒2個非葡萄酒樣品作為對照。

標準品：草酸(99.5%)(Oxalic acid)、酒石酸(99.5%)(Tartaric acid)、蘋果酸(99.5%)(Malic acid)、乙酸(99.7%)(Acetic acid)、檸檬酸(99.5%)(Citric acid)、琥珀酸(99.5%)(Succinic acid)、乳酸(99.9%)(Lactic acid)，德國Dr. Ehrenstorfer 公司。甲醇(色譜純)，迪馬公司；磷酸二氫鉀、磷酸(分析純)，北京化學試劑公司。

儀器與設備：島津LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)配二元高壓泵、二極管陣列檢測器、SIL-20A型自動進樣器、柱溫箱、色譜數據工作站，固相萃取儀，石墨化碳黑固相萃取柱。

1.2 方法

1.2.1色譜條件及標準品的配制

色譜柱：ST PAK C18-ES (5 μm，250 mm×4.6 mm, 120 A)；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀，磷酸調pH值至2.5；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：40℃；進樣量：20 μL。

分別稱取有機酸標準品100 mg左右至10 mL棕色容量瓶中，加入少量水震蕩超聲至完全溶解，用水定容至刻度搖勻，保證每種標準品質量濃度都在10 mg/mL左右，于4℃冰箱中儲存。

1.2.2葡萄酒中有機酸定性及定量分析

稱取葡萄酒樣品10.00 g至100 mL容量瓶中，用水定容，渦旋振蕩搖勻。分別用10 mL甲醇、10 mL水活化石墨化碳黑固相萃取小柱，將稀釋好的葡萄酒樣品過柱除去雜質，流速控制在1.0～1.5 mL/min范圍，棄去前6 mL流出液，收集后段流出液，過0.2 μm針頭過濾器(聚醚砜)，濾液用于高效液相色譜分析。

根據每種標準樣品的單標保留時間來確定有機酸的出峰時間，并用200～500 nm波段掃描的特征譜圖進行驗證。采用峰面積外標法對有機酸進行定量。

2 結果與分析

2.1 有機酸高效液相色譜方法

首先，根據試湊實驗法[27]獲得最佳色譜條件，使待測7種有機酸達到良好的基線分離，所有色譜峰之間的分離度均大于1.5，能夠達到完全分離，并且峰形尖銳，對稱性好，可滿足葡萄酒中7種有機酸的同時分離(圖1)。同時，在該條件下，方法的線性關系與檢出限、精密度與回收率如表1、2所示。

圖1 7種有機酸標準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of seven organic acid standards

表1 7種有機酸對照品標準曲線方程Tab.1 Retention time, regression equation and limit of detection of seven organic acids

表2 添加質量濃度、回收率與精密度Tab.2 Recoveries and relative standard deviationsof seven organic acids

由表可見方法回收率在95%～102%之間；相對標準偏差小于3%，滿足試驗對準確度和精密度的要求。

2.2 年份葡萄酒中有機酸特征分析

2.2.1年份紅葡萄酒

本研究分析了年份對葡萄酒中有機酸含量的影響，所分析樣品均為同一品種(紅葡萄酒：赤霞珠；白葡萄酒：霞多麗)。年份紅葡萄酒有機酸分布如圖2所示。

圖2 年份紅葡萄酒有機酸分布Fig.2 Organic acid distribution diagrams of red vintage wines

首先，不同年份的紅葡萄酒有機酸表現出了一定的年份特征，如2011年份葡萄酒中草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸含量均較低(圖2a、2b、2e、2f)，不同年份的葡萄酒中，各有機酸組成與比例也略有不同(圖2i)。其次，蘋果酸與乳酸呈現出了良好的負相關性(圖2c、2d)，如2011年份蘋果酸含量最高，相應地，乳酸含量則最低；其他年份也類似，即蘋果酸含量高，則乳酸含量低，反之亦然。原因在于葡萄酒中的乳酸主要來自于蘋果酸-乳酸發酵過程[1-2, 4]，而該發酵過程是否進行取決于酒精發酵完成后葡萄酒中酸感的強弱。本研究中，2011年份葡萄酒，其蘋果酸含量遠高出其他年份葡萄酒，原因為該年份未進行蘋果酸-乳酸發酵。2002—2011年，該酒莊的同一葡萄園生產的赤霞珠葡萄酒，其有機酸含量總和基本保持穩定(圖2h)，略有波動；葡萄酒中主要的有機酸均為酒石酸與乳酸，并保持較高的比例，各有機酸比例略有波動(圖2i)；表明有機酸是酒莊和葡萄園較為重要的固有特征之一，而不同年份的不同氣相條件會造成一定的影響，導致其有機酸含量和組成的波動。

2.2.2年份白葡萄酒

年份白葡萄酒有機酸分布如圖3所示。首先，不同年份的白葡萄酒有機酸也表現出了一定的年份特征，與紅葡萄酒一樣，2011年份葡萄酒中草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸含量均較低(圖3a、3b、3e、3f、3g)。結合年份紅葡萄酒數據(圖2a)，2011年氣候應與其他年份有明顯不同。北京地區2011年出現近41年來最重秋冬連旱[28]，而在冷涼氣候條件下，葡萄的酸度能夠得到較好的積累，而高溫干旱氣候會導致葡萄中有機酸積累的減少[1]，這可能是2011年份的紅、白葡萄酒中有機酸含量均有所降低的原因。這表明年份間氣候的不同對于葡萄酒中有機酸含量和組成有一定的影響。蘋果酸與乳酸呈現出了良好的負相關性，這與紅葡萄酒中表現類似(圖3c、3d)。此外，由圖3c、3d還可以看出，2003年和2007年，該酒莊白葡萄酒進行了蘋果酸-乳酸發酵，而2004、2005、2008、2009、2011年份未進行發酵。蘋果酸酸感相對較高，而就紅、白葡萄酒風格來講，較高的酸度能夠給白葡萄酒帶來更好的口感[29]。這應該是該酒莊在多數年份未選擇對白葡萄酒進行蘋果酸-乳酸發酵的原因。2003—2011年，該酒莊同一葡萄園生產的霞多麗葡萄酒，其有機酸含量總和，以及各有機酸含量均發生了顯著的變化(圖3)，表明年份對于白葡萄酒的影響遠大于紅葡萄酒。

此外，其有機酸組成與紅葡萄酒也明顯不同，白葡萄酒中檸檬酸含量很高，蘋果酸為主要的有機酸，其次為酒石酸(圖3i)；而紅葡萄酒中主要為酒石酸和乳酸，檸檬酸含量很低(圖2i)。這與成冰等[30]的報道略有區別，原因可能在于取樣酒莊釀造風格的不同。

圖3 年份白葡萄酒有機酸分布Fig.3 Organic acid distribution diagrams of white vintage wines

2.3 品種葡萄酒中有機酸特征分析

2.3.1品種紅葡萄酒

不同品種葡萄釀制的葡萄酒均具有其獨特的品種風格[4-5,7-9]。本研究分析了品種對葡萄酒中有機酸含量的影響，品種紅葡萄酒有機酸分布如圖4所示。

圖4 品種紅葡萄酒有機酸分布Fig.4 Organic acid distribution diagrams of red variety wines

首先，不同品種紅葡萄酒中，草酸(圖4a)、酒石酸(圖4b)、乳酸(圖4d)、檸檬酸(圖4f)含量顯著不同，琥珀酸(圖4g)與乙酸(圖4e)品種間區別不大。其次，所測定樣品中，除馬瑟蘭外，其余4個品種紅葡萄酒均進行了徹底的蘋果酸-乳酸發酵(圖4c、4d)。在5個紅葡萄品種上，酒石酸和乳酸均為最主要的有機酸，除赤霞珠、蛇龍珠為乳酸含量最高外，其余3個品種均為酒石酸含量最高。這與成冰等[30]報道的新疆產區的釀酒葡萄有機酸特征略有區別，原因可能在于產地一定程度上改變了葡萄的有機酸特征[6-8]。

2.3.2品種白葡萄酒

品種白葡萄酒有機酸分布如圖5所示。

圖5 品種白葡萄酒有機酸分布圖Fig.5 Organic acid distribution diagrams of white variety wines

首先，不同品種白葡萄酒中，所測7種有機酸品種間均具有顯著性差異(圖5a～5g)，有機酸總量也差異很大(圖5h)。其中，霞多麗具有最高的有機酸總量，其次為白玉霓、龍眼、維歐尼、雷司令、貴人香。在新疆產區[30]釀酒葡萄研究中，有機酸總量從大到小依次為霞多麗、白玉霓、雷司令、貴人香，與本研究完全相同，表明雖然產區(風土特征)會影響葡萄酒有機酸組成，但在不同產區，品種自身特性仍然能夠得到表現[31]。其次，所測定樣品中，除雷司令外，其余5個品種白葡萄酒均未進行蘋果酸-乳酸發酵(圖5c、5d)，這與白葡萄酒的風格有關[29]。在6個白葡萄品種上，除進行了蘋果酸-乳酸發酵的雷司令主要有機酸為酒石酸和乳酸外，其余5個品種白葡萄酒主要有機酸均為蘋果酸和酒石酸。這與成冰等[30]研究結果基本相同。

與年份葡萄酒結果(圖2、3)對比可以發現，品種對葡萄酒中有機酸的影響遠大于年份對葡萄酒中有機酸的影響。綜合紅、白品種葡萄酒數據可以發現，不同品種葡萄酒具有顯著不同的有機酸特征，表明有機酸是葡萄酒重要的特征物質。但是本研究樣本數量較少，無法定性定量表述各個葡萄酒品種的有機酸特征。未來研究中，可以通過大批量樣品調研，分析確定各個品種葡萄酒的有機酸特征，從而能夠應用單獨或結合其他葡萄酒中特征物質用來鑒定葡萄酒品種、年份以及產地。TANG等[7]結合使用有機酸和多酚，成功鑒定了葡萄酒的品種以及葡萄酒的產地。

2.4 市場葡萄酒中有機酸特征分析

本研究對我國市場葡萄酒(北京市場為例)的有機酸含量狀況進行了分析，結果如圖6所示。

圖6 北京市售葡萄酒有機酸分布Fig.6 Organic acid distribution diagrams of Beijing market wines

首先，葡萄酒中有機酸(圖6a～6g)與其他酒類中有機酸有明顯的特征區別(圖6h)，蘇格蘭威士忌(圖6h,樣QT1)中檢出6種有機酸(除檸檬酸外)，中國勁酒(圖6h, 樣QT2)中只檢出了草酸，兩類非葡萄酒中有機酸總量均顯著低于葡萄酒，只有葡萄酒中有機酸總量的約1/10。其次，北京市場葡萄酒中有機酸品質狀況整體較好。但是，檢出了5款干紅葡萄酒中檸檬酸含量超出國家標準[31]，分別為通化產區樣品TH2和TH5(圖6b)，以及煙臺產區YT8、YT9、YT13(圖6d)，超標檢出率為4.9%。其中，TH2和TH5檸檬酸質量濃度分別為4.09 mg/mL和5.06 mg/mL，是國家標準(1 mg/mL)4～5倍，檸檬酸占總有機酸百分比分別為75%和87%，經北京市產品質量監督檢驗所后續抽檢確定，該兩款產品均為勾兌生產的假酒，其生產商為通化當地某兩家小型企業。此外，煙臺產區YT8、YT9、YT13檸檬酸質量濃度分別為1.47、1.57、1.49 mg/mL，超出國家標準，同時檸檬酸所占百分比(分別為34%、27%和39%)顯著高于其他葡萄酒樣品，查閱樣品信息，發現該3個樣品均來自煙臺產區某企業，而且該3個樣品均為異地酒灌裝生產，雖未經質檢部門后續檢驗確定，但也極有可能為勾兌灌裝的假酒。這表明使用檸檬酸總量及檸檬酸占有機酸總量比值，可以初步地檢測勾兌假酒，尤其是“三精一水”勾兌的低劣等葡萄酒。

紅、白葡萄酒樣品有機酸區別明顯，所測92款紅葡萄酒(剔除5款問題樣品后)中主要有機酸均為酒石酸和乳酸，同時檸檬酸含量較低(圖6a～6f)；而所測6款白葡萄酒中，主要有機酸均為蘋果酸和酒石酸，同時具有較高的檸檬酸含量(圖6g)。這與紅、白葡萄酒風格不同有關[29]。

同時，所測92款紅葡萄酒樣品，不同樣品有機酸分布范圍以及各有機酸所占比例值分布廣泛，原因可能是因為所取樣品來自不同產區、不同品種。與此同時，這些樣品所使用的釀造工藝、所使用釀酒酵母、陳釀時間等均具有較大差別，而這些因素均會不同程度上影響葡萄酒中有機酸的組成[1,4-5,7,9,32-38]。

比較國產紅葡萄酒(圖6a～6e)與進口紅葡萄酒(圖6f)，進口紅葡萄酒中酒石酸所占有機酸總量比值顯著高于國產紅葡萄酒中該值，而乳酸所占有機酸總量比值顯著低于國產紅葡萄酒中該值。所測進口葡萄酒基本均來源于歐洲，氣候條件與我國不同，同時產品類型多為陳釀型葡萄酒有關[9,29,33,39]。比較所測5個國內產區(北京、通化、沙城、煙臺、天津)(圖6a～6e)，不同產區也有不同的特點，如通化產區琥珀酸含量均較低(圖6b)，北京產區乳酸所占有機酸總量比值(圖6a)顯著高于其他產區等。這表明產區會顯著影響葡萄酒中有機酸含量。比較北京產區5家不同生產商(圖6a)，也能夠發現一定的區別，如生產商A，其蘋果酸含量以及占有機酸總量比值均顯著高于其他4家生產商。這表明不同酒莊的不同釀造風格也會顯著影響葡萄酒中有機酸含量。

3 結論

(1)建立了葡萄酒中7種常見有機酸的HPLC檢測方法，在最優色譜條件下7種有機酸均得到了很好的分離，經方法學驗證，各有機酸的線性關系良好，檢測限低，加樣回收率準確度較高，相對標準偏差較好。使用該方法對年份葡萄酒和品種葡萄酒進行了分析，發現年份和品種均對紅、白葡萄酒中有機酸有一定的影響，其中品種的影響較大，年份的影響則較小，年份對于白葡萄酒的影響遠大于紅葡萄酒。

(2)紅、白葡萄酒有機酸組成也明顯不同，紅葡萄酒中主要為酒石酸和乳酸，檸檬酸含量很低；而白葡萄酒中檸檬酸含量很高。綜合紅、白品種葡萄酒數據可以發現，不同品種葡萄酒具有顯著不同的有機酸特征，表明有機酸是葡萄酒重要的特征物質。但是本研究樣本數量過少，無法定性定量表述各個葡萄酒品種的有機酸特征。

(3)使用該方法對北京市售葡萄酒有機酸含量狀況進行了分析。所測103款葡萄酒樣品中，檸檬酸超標僅有5例，超標檢出率為4.9%，表明北京市場葡萄酒中有機酸品質狀況整體較好。使用有機酸可以有效區分葡萄酒與非葡萄酒；使用檸檬酸總量以及檸檬酸與有機酸總量比例值，可以初步檢測勾兌假酒，尤其是“三精一水”勾兌的低劣等葡萄酒。此外，進口葡萄酒與國產葡萄酒、不同產區葡萄酒、不同酒莊葡萄酒有機酸特征均不相同。

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