兔病毒性出血癥重組桿狀病毒HP-VP60的構(gòu)建及鑒定

龔文波，田麗梅，于作，古靜，方鵬飛

（華派生物工程集團有限公司，四川 簡陽 641400）

兔出血癥（RHD）俗稱兔瘟，是一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，以呼吸系統(tǒng)出血和實質(zhì)器官水腫、淤血及出血性變化為特征，可引起兔群大批發(fā)病和死亡[1]。RHD病毒基因組中的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60是病毒的免疫保護性抗原，在誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)中起重要作用[2]。本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了表達RHDV LQ株VP60蛋白的重組桿狀病毒HP-VP60，并對其表達產(chǎn)物的血凝效價及免疫原性等進行鑒定，結(jié)果顯示該重組桿狀病毒的表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性，可用于制備RHDV亞單位疫苗。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細胞 pT-VP60質(zhì)粒（含有RHDV LQ株VP60基因）由華派生物質(zhì)檢研發(fā)中心構(gòu)建；pFastBacDual桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體、DH10Bac感受態(tài)細胞和Sf9細胞由華派生物質(zhì)檢研發(fā)中心保存。

1.2 主要試劑 DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、醋酸纖維素膜（NC膜）購自天根生化科技有限公司；ExTaq DNA 聚合酶、DNA Marker、T4 DNA 連接酶以及其他限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物工程有限公司；DNA-RNA共提取試劑盒和RHDV兔高免血清由華派生物質(zhì)檢研發(fā)中心自制；HRP標記的羊抗兔IgG抗體、FITC標記的羊抗兔IgG抗體購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、胎牛血清購于Thermo Fisher公司；SF-SFM培養(yǎng)基購自蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 本文引物序列見表1，由上海英濰捷基有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 VP60基因的擴增與克隆 分別用VP60F1/VP60R1引物和VP60F2/VP60R2引物，以pT-VP60質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)，擴增出VP60/EH和VP60/KN基因片段，然后克隆入pMD19-T載體上，經(jīng)菌落PCR及相應(yīng)酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒送上海英濰捷基有限公司測序，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pTVP60/EH和pT-VP60/KN。

1.5 重組桿粒Bac-VP60的構(gòu)建 用EcoRI和HindIII雙酶切pFastBacDual和pT-VP60/EH質(zhì)粒，將VP60基因克隆入pFastBacDual載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacDual-VP60。然后再通過NheI和KpnI雙酶切將VP60基因克隆入pFastBacDual-VP60上，所得到的重組質(zhì)粒命名為pFastBacDual-2VP60。用pFastBacDual-2VP60質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，再涂布到LB-Bac平板（含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素、10μg/mL四環(huán)霉素、100μg/mL X-gal和 40μg/mL IPTG），37℃培養(yǎng) 48h。挑取白色單菌落，重新劃線于LB-Bac平板，37℃培養(yǎng)24h后，再挑取白色單菌落接種于LB-Bac液體培養(yǎng)基（含有50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 慶大霉素、10 μg/mL 四環(huán)霉素），37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組桿粒分別用P10F/P10R、PH-Profor/SV40-PArev和 VP60F1/VP60R1引物進行PCR鑒定，鑒定正確的重組桿粒命名為Bac-VP60。

1.6 重組桿狀病毒HP-VP60的獲得及傳代 參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書，將重組桿粒Bac-VP60轉(zhuǎn)染Sf9細胞，轉(zhuǎn)染后每日觀察細胞形態(tài)，待細胞出現(xiàn)直徑變大、產(chǎn)生泡狀物、脫落等明顯病變時收獲細胞培養(yǎng)物，以2620r/min離心5min，收獲上清即為重組桿狀病毒母液（F0代病毒），命名為HPVP60。將F0代病毒液以1%體積比接種Sf9細胞，接毒后72～96h收獲細胞培養(yǎng)物，以2620r/min離心5min，收獲上清即為F1代病毒，分裝后短期可于4℃避光保存，長期應(yīng)于-70℃保存。

1.7 重組桿狀病毒HP-VP60的鑒定 根據(jù)DNARNA共提取試劑盒說明書提取重組桿狀病毒HPVP60的基因組DNA，用VP60F1和VP60R1引物進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：基因組DNA 2.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，10mM dNTP 2.5μL，Ex Taq 1μL，上下游引物各 1μL，ddH2O 37μL。反應(yīng)程序為：93℃ 3 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，30 個循環(huán)；72℃ 10min。

1.8 IFA檢測重組桿狀病毒表達產(chǎn)物 在96孔細胞培養(yǎng)板上，將F1代重組桿狀病毒HP-VP60接種到對數(shù)生長期的Sf9細胞，培養(yǎng)至產(chǎn)生病變時進行IFA檢測，同時設(shè)未接毒的正常Sf9細胞作對照。操作步驟如下：吸棄96孔板中的培養(yǎng)液，用1×PBS洗2次，加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇于室溫下固定30 min；再用1×PBS洗3次，加入1∶50倍稀釋的兔RHDV高免血清，37℃作用1h；1×PBS洗3次，加入1∶100倍稀釋的FITC標記的山羊抗兔IgG，37℃下避光作用1h；1×PBS避光洗3次，然后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 Western Blot法檢測重組桿狀病毒表達產(chǎn)物 將收獲的F1代病毒液感染Sf9細胞，72h后收獲上清進行SDS-PAGE電泳，同時以感染非重組野生型桿狀病毒的Sf9細胞以及未被感染重組桿狀病毒的Sf9細胞作為陰性對照和空白對照，然后轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜（NC膜），用5%脫脂奶粉封閉過夜。用1×TBST洗滌3次，加入1∶100倍稀釋的RHDV兔高免血清，37℃作用1h；用1×TBST洗滌3次，加入1∶2 000倍稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37℃作用1h；1×TBST洗3次，然后用DAB顯色、觀察。

1.10 電鏡觀察 將收獲的病毒液進行蔗糖密度梯度超速離心，取純化的病毒樣顆粒，用2%磷鎢酸鈉溶液負染，電鏡下觀察。

1.11 表達蛋白的血凝效價測定 在96孔“V”形血凝板中每孔先加入50μL滅菌生理鹽水，然后在第1孔內(nèi)分別加入50μL感染重組病毒的細胞培養(yǎng)物，混勻后，吸取50μL加入到第2孔中，如此連續(xù)稀釋至第11孔，第11孔吸取50μL液體棄掉；第12孔為滅菌生理鹽水對照，陰性細胞培養(yǎng)物按相同方法稀釋；然后每孔加入50 μL 1%的人O型紅細胞懸液，混勻，37℃下作用30min后觀察結(jié)果。

1.12 表達蛋白的免疫原性測定 將收獲的病毒液上清，經(jīng)二乙烯亞胺（BEI）滅活后，制備成氫氧化鋁膠滅活疫苗，接種10只1.5～3.0kg健康易感家兔，每只頸部皮下注射0.5mL。14日后，將10只免疫兔與10只同條件、同來源的對照兔，分別頸部皮下注射1∶9稀釋的兔病毒性出血癥病毒（肝、脾毒）1.0mL，攻毒后連續(xù)觀察7d，記錄家兔死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組桿狀病毒HP-VP60鑒定 提取重組病毒基因組DNA，以VP60F1和VP60R1引物進行PCR鑒定，結(jié)果得到一條1740 bp電泳條帶（圖1），與目的基因大小一致，說明VP60基因已經(jīng)整合入重組桿狀病毒基因組中。

圖1 PCR鑒定重組桿狀病毒HP-VP60凝膠電泳圖

2.2 重組桿狀病毒HP-VP60表達產(chǎn)物的IFA鑒定 IFA鑒定結(jié)果顯示：感染重組桿狀病毒的細胞具有很強的特異性熒光，而作為陰性對照的正常Sf9昆蟲細胞無特異性熒光出現(xiàn)，說明VP60蛋白得到了表達。

2.3 重組桿狀病毒HP-VP60表達產(chǎn)物的Western Blot鑒定 對F1代病毒感染Sf9細胞72h后收獲的上清進行Western Blot分析，結(jié)果在60kDa處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶，而感染非重組野生型桿狀病毒的Sf9細胞懸液和正常Sf9細胞懸液均無條帶出現(xiàn)。說明VP60蛋白在Sf9細胞中成功表達。

2.4 電鏡檢測 電鏡下可見大小約35～40 nm的病毒樣顆粒，與RHDV病毒粒子大小相當、形態(tài)學(xué)相近。

2.5 表達蛋白的血凝效價測定 血凝試驗結(jié)果顯示：重組桿狀病毒HP-VP60的表達產(chǎn)物能凝集人O型紅細胞懸液，血凝效價為1∶4096。

2.6 免疫原性檢測 將收獲的病毒液上清滅活，制備氫氧化鋁膠滅活疫苗，進行家兔攻毒保護實驗。結(jié)果顯示：免疫組家兔100%保護，對照組家兔全部死亡（表2），表明構(gòu)建的重組桿狀病毒HP-VP60表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

表2 免疫原性試驗結(jié)果

3 小結(jié)

RHDV不能在雞胚上增殖，也難于在各種原代或傳代細胞中穩(wěn)定增殖。目前廣泛使用的疫苗為組織滅活苗。近年來，新型疫苗的研究主要集中在基因工程疫苗的研制上，現(xiàn)已在大腸桿菌、釀酒酵母、痘苗病毒以及植物等多種表達系統(tǒng)中表達了VP60蛋白[3-5]。但是，目前RHDV基因工程疫苗研究中仍然存在一些問題：大腸桿菌表達的VP60蛋白以包涵體形式存在，具有不可溶性和免疫效果較差的缺點，應(yīng)用前景并不樂觀；重組病毒疫苗存在向環(huán)境擴散經(jīng)遺傳修飾的生物安全問題；采用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)VP60的表達水平目前還不理想。因此，研制RHD安全、高效的新型疫苗勢在必行。

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達效率高，表達的蛋白抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似，生物活性較強，并且可以實現(xiàn)全懸浮培養(yǎng)，利用該系統(tǒng)表達外源蛋白，經(jīng)濟、高效。本研究利用昆蟲桿狀病毒Bacto-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒HP-VP60，用該重組桿狀病毒感染Sf9細胞后能夠表達出VP60蛋白，且在細胞內(nèi)能自動組裝成病毒樣顆粒（VLP）。將表達出的VLP制備成疫苗后免疫家兔，能夠100%保護家兔免受強毒攻擊。

[1] 李岳余，張立穎.兔病毒性出血癥的防治[J].中國動物保健，2016，18（3）：27-28.

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[3] Boga J A，Casais R，Marin M S，et al.Molecular cloning，sequencing and expression inEscherichia coliof the capsid protein gene form rabbit haemorrhagic disease virus（Spanish isolate AST/89）[J].J General Virol，1994，75（9）：2409-2413.

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[5] 李嬌，王艷，王文秀，等.我國兔病毒性出血癥疫苗研究與應(yīng)用進展[J].中國養(yǎng)兔，2015（3）：21-24.