某豬場豬流行性腹瀉病的病原檢測

胡宏偉 ，余麗花 ，樊延明 ，李志賽 ，肖嘯 ，代飛燕

（1.云南省易門縣動物衛生監督所，云南 易門 651100；2.云南省香格里拉市動物衛生監督所，云南 香格里拉 674400；3.云南省華坪縣通達鄉農業綜合服務中心，云南 華坪 674800；4.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201；5.云南農業大學動物醫院，云南 昆明 650031）

豬流行性腹瀉是一種由豬流行性病毒引起的急性、高度接觸性腸道傳染病[1]，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是冠狀病毒科冠狀病毒屬的一員。發病豬是本病的主要傳染源，病毒主要分布在腸系膜淋巴結和小腸絨毛上皮細胞，隨糞便排出后通過污染環境中的飼料、飲用水及生產設備等進行傳播[2]。一周齡仔豬腹瀉達3～4d，表現為嚴重脫水，死亡率達50%，最高為100%[3]。近年從中國分離到的CV777毒株是該病毒的一個新基因型[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 從山東夏津縣某豬場隨機選擇10頭未經治療的流行性腹瀉病死仔豬。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫膠體金層析試紙檢測 取免疫膠體金檢測試紙，在吸附孔中加入病死仔豬的腸內容物樣品，吸附3min，即可獲得免疫膠體金層析試紙的檢測結果。

1.2.2 熒光定量PCR檢測

1.2.2.1 檢測樣品 豬場里腹瀉癥狀明顯的哺乳仔豬小腸內容物，環境取樣棉拭子及料線中的母豬飼料樣品。小腸內容物取樣：用消毒棉線結扎一段小腸的兩端，用火焰灼燒后的刀片在結扎端外側割斷腸管。從采集的10份病豬腸道內容物中隨機抽取4份進行檢測，從5份料線樣品和5份環境樣品中分別抽取2份進行檢測。

待檢病料處理：用0.01mol/L磷酸緩沖液將病料稀釋成10%的懸液，然后1000r/min離心10min。取上清，加入氨芐青霉素和鏈霉素，在37℃溫箱中作用 1～2 h，-70℃下保存備用。

1.2.2.2 病毒增殖 將處理好的病料接種于長滿單層的IBRS-2細胞，盲傳幾代至出現明顯細胞病變，收集病毒液-70℃凍存待用。IBRS-2細胞的培養方式根據常規傳代培養方法進行。

（1）引物設計：參考劉鄧等[4]發表的“Taq Man熒光定量PCR檢測豬流行性腹瀉病毒”的方法設計上游引物 P1 為 5′-AACAAATCCAGGGCCACTT-3′，下游引物 P2 為 5′-TAAACTGGCGATCTGAGCA-3′。

（2）病毒核酸的提取：取300μL徹底融化的病毒液，加入500μL裂解液RL，室溫靜置2min，將gDNA Eraser Spin Column安放到2mL Collection Tube上，將裂解液轉移到gDNA Eraser Spin Column中；12000r/min 離心 1min，棄 DNA Eraser Spin Column，保留2mL Tube中的濾液；然后加入等體積的70%乙醇，使用移液槍將溶液混合均勻，立即全部轉入RNA Spin Column中；12000r/min離心1min，棄濾液；加入500 μL Buffer RWA 至RNA Spin Column中，12000r/min離心30s，棄濾液；加入600μL Buffer RWB至RNA Spin Column中，12000r/min離心30s，棄濾液，然后重復此步驟；將RNA Spin Column重新安置于Collection Tube上，12 000 r/min離心2 min；再次將RNA Spin Column安置于1.5 mL RNase-Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央處加入50μL RNase-Free ddH2O，室溫靜置5min；12 000r/min離心2min，洗脫RNA；采用紫外吸收法測定RNA純度。

（3）反轉錄合成病毒cDNA：使用通用引物作為反轉錄引物，根據表1反轉錄系統和條件合成病毒cDNA。

表1 反轉錄反應體系

（4）用反轉錄合成的cDNA進行熒光定量PCR擴增，反應體系如表2所示。反應條件為：95℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min，40 個循環。

2 結果

2.1 免疫膠體金層析試紙檢測 免疫膠體金層析試紙檢測結果（圖1）顯示：對照線（C線）為陽性，對照成立；檢測線（T線）為陽性，樣品判斷為陽性。

圖1 免疫膠體金層析試紙檢測結果

2.2 熒光定量PCR檢測 結果（表3）顯示：檢測樣品 1、2、3、4 均為 PEDV陽性。

表3 腸內容物熒光定量PCR檢測結果

為進一步確定引起此次豬流行性腹瀉的來源，我們同時對豬場內的環境采樣和料線采樣進行了檢測，結果顯示：料線樣品1、2和環境樣品1、2均為PEDV陽性，如表4所示。

表4 環境和料線樣品的熒光定量PCR檢測結果

3 討論

與常規PCR相比，本試驗使用的熒光定量PCR不僅可以定量檢測，而且更具體、更靈敏。料線檢測結果呈陽性，提示本次豬流行性腹瀉病毒很可能來源于料線中，環境樣品檢測結果呈陽性，是因為場內豬只感染病毒后持續向外排毒引起環境污染，故要定期對豬場環境進行消毒。

4 結論

通過免疫膠體金層析試紙進行初篩，再用熒光定量PCR進行驗證，最終確定引起該豬場仔豬流行性腹瀉的病原為PEDV，且病原主要來自料線中，所以要注意料線的安全性。

[1] 甘振磊，李春燕，王彬，等.豬流行性腹瀉特點及流行現狀的研究[J].豬業科學，2010（12）：24-28.

[2] 羅滿林.動物傳染病學[M].北京:中國林業出版社，2013：195-200.

[3] 施標，董世娟，朱于敏，等.中國豬流行性腹瀉病毒分子流行病學研究進展[J].中國農業科學，2013，46（20）：4362-4369.

[4] 劉鄧，袁秀芳，冉多良，等.TaqMan熒光定量PCR檢測豬流行性腹瀉病毒方法的建立與初步應用[J].中國動物傳染病學報，2010，18（1）：28-33.