蘿卜雄性不育研究進展

王俊峰　蘭成云　孫楊　呂曉惠　朱嬌　馬蕾　韓偉

摘要：Ogura類型雄性不育是蘿卜細胞質雄性不育研究最深入、最優秀的材料。本文總結了Ogura雄性不育主控基因orf138在細胞學、遺傳學與分子生物學方面的研究進展，闡述了Ogura類型雄性不育在蘿卜育種領域的研究現狀，指明了orf138研究在今后蘿卜雜交育種研究中的方向和重要意義。

關鍵詞：蘿卜；Ogura雄性不育；orf138；雜交育種；

中圖分類號：S631.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0159-04

Abstract Ogura type male sterility is the most in-depth and best material for the study of cytoplasmic male sterility in radish. In this paper，we summarized the research progress of Ogura male sterility master gene orf138 in cytology， genetics and molecular biology， elaborated the research status of Ogura cytoplasmic male sterility in radish breeding field， and pointed out the direction and significance of orf138 research in radish cross breeding in the future.

Keywords Raphanus sativus L.； Ogura male sterility； orf138； Hybrid breeding

蘿卜（Raphanus sativus L.）屬于十字花科蘿卜屬，是一種一年生或兩年生的重要蔬菜。蘿卜起源于我國，在長期的栽培中，形成了豐富多樣的品種類型。蘿卜是異花授粉作物，具有顯著的雜種優勢，但由于花器較小，人工去雄操作費時費力，且一次授粉獲得的雜交種子很少，為解決這一問題，早期育種工作者選用自交不親和系育種。但自交不親和系易受環境等因素的影響，造成親和性不穩定，經常出現制種純度不高的現象。利用植物雄性不育系進行雜交制種，可較好地解決自交不親和系制種的問題，提高雜交種子純度，增加農作物產量，已成為國際種業育種的主要發展方向。

1 蘿卜細胞質雄性不育類型及Ogura主控基因orf138的類型 蘿卜雄性不育的研究最早起源于日本。1968年小倉在日本的鹿兒島蘿卜中首先發現了Ogura細胞質雄性不育CMS（cytoplasmic male sterility），此后科技人員對Ogura雄性不育進行了長期深入的研究。我國對蘿卜雄性不育的選育及育種工作始于20世紀70年代初，山東[1]、遼寧、河南和山西[2]等地先后在蘿卜地方品種中發現了雄性不育材料，隨后相繼開展了蘿卜雄性不育育種工作，并在很短時間內就育出了雜交種，并應用于生產。后經DNA測序比對分析，我國目前發現的蘿卜細胞質雄性不育材料都屬于Ogura類型[3，4]。

細胞質雄性不育是一種由細胞質基因和細胞核基因共同互作形成的雄性不育現象[5]。蘿卜的細胞質雄性不育一般有 Ogura-CMS （orf138）、Kos-CMS （orf125）[6]、DCGMS-CMS[7，8]和NWB-CMS[9]等類型，但最常見的還是Ogura不育類型。Ogura雄性不育不僅是迄今所知的所有蘿卜雄性不育類型中在導入率和穩定性方面最優秀的不育材料，同時也是研究最為深入的一種雄性不育材料。日本學者Yamagishi通過對蘿卜野生種、栽培種等不育材料進行測序，將Ogura雄性不育基因orf138分為A到I九個類型[10]。據有關資料研究，雖然不同類型間堿基發生了變異，有的還導致氨基酸發生了變化，但A型與F型具有相同的恢復和保持關系[11，12，]，從目前已發現的不育材料看，能夠明確導致雄性不育的有A、B、D、F、H型，其它類型還有待驗證。

2 orf138蛋白積累與育性的關系

大多數研究者認為，Ogura類型雄性不育的主控基因為orf138 [13，14]。orf138基因存在于蘿卜線粒體基因組內，其編碼的蛋白位于線粒體內膜上[13，15]。orf138蛋白能夠顯著抑制細菌的生長，據推測orf138基因能產生對花藥絨氈層線粒體活性具有一定毒性的蛋白[16]。細胞質雄性不育基因對花粉敗育的機理已在水稻上有了一定研究進展。Luo的課題組曾報道，在水稻線粒體中發現了一個起源于野生稻的新基因WA352，它編碼的蛋白能夠與細胞核編碼的COX11蛋白發生互作。WA352積累優先發生在花藥絨氈層，從而抑制COX11在過氧化物代謝中的功能，進而引發絨氈層細胞的程序性死亡和花粉不育。而另外兩個育性恢復基因RF3和RF4的表達又能夠抑制WA352的表達，從而恢復水稻的育性。此外，在水稻野敗不育系和可育株系中還發現了兩個線粒體基因組單拷貝ATP合成酶基因apt6 和orfB[17]。而在蘿卜中發現，orf138與線粒體基因組中具有正常功能的orfB基因共轉錄，產生異常轉錄本和翻譯產物，從而在花藥發育的某個時期干擾線粒體的正常功能發揮，最終導致雄性不育現象的發生[15]。orfB與小麥、高粱和玉米中的atp8基因同源性分別為95%、96%和94%。這表明，orfB也是一種ATP合成酶基因。

盡管現在對雄性不育基因造成花粉敗育的機理還不明確，但是，無論是細胞質不育還是細胞核不育，也不論是哪種作物，導致不育的原因主要指向花藥絨氈層的發育異常。絨氈層是花藥壁的最內層，它包圍在生殖細胞周圍，為花粉發育提供養分，對花粉發育具有重要作用[18，19]。由于絨氈層對花粉發育的重要性，人們開始著重研究影響絨氈層發育的相關基因，并在對擬南芥雄性不育的研究中先后發現了ACOS5、A6、LTP12、LAP5、TSM1、TAP35、TAP44、A9等基因與絨氈層發育有關[20-22]。為了發現更多的與絨氈層發育相關的基因，Ma等[23]利用甘藍NiCMS和OguCMS細胞質雄性不育、細胞核隱性雄性不育（RGMS）和顯性雄性不育（DGMS）4份材料進行了花蕾的轉錄組研究，發現104個無花粉表達基因（non-pollen expressed genes，NPGs），這些基因絕大部分與絨氈層的發育有關，其中有22個基因之前已經進行了報道，并對5個基因進行了原位雜交熒光定位。

近年也有人開始利用小RNA進行雄性不育研究。Wei等對Ogura雄性不育大白菜的miRNA研究發現，有兩個新型的miRNAs在Ogura雄性不育型的花蕾中高表達，并抑制了兩個花粉發育關鍵基因SUC1和H+-ATPase6的表達[24]。這表明，在花蕾和花藥的發育過程中，可能存在這樣一個miRNA調控網絡。

3 orf138與恢復基因PPR-B的關系

蘿卜細胞質雄性不育的育性可以通過恢復基因來恢復。1987年何啟偉利用不育系與恢復系雜交后代的分離情況推測，蘿卜Ogura類型的細胞質雄性不育系育性恢復基因由位于細胞核中的兩對顯性基因（MS1MS1MS2MS2）所控制，恢復系基因型為SMS1MS1MS2MS2或NMS1MS1MS2MS，不育系基因型為Sms1ms1ms2ms2，保持系基因型為Nms1ms1ms2ms2（S為不育型細胞質，N為正常細胞質）[1]。

研究表明，當用恢復系與不育系進行雜交時，恢復系中的恢復基因能夠產生一種PPR蛋白（pentatricopeptide repeat proteins）[11，12，25]，該蛋白能夠抑制orf138蛋白在花藥絨氈層的積累，從而達到育性恢復的目的。PPR是一種三角狀五肽重復結構域，具有該結構域的蛋白質家族是植物最大的蛋白家族之一。目前，PPR蛋白的結構特征已經基本清楚，其序列N端大都具有線粒體或葉綠體定位序列，其后為2～27個串聯重復的PPR結構域，PPR結構域之間通過形成具有結合溝的超螺旋結構結合單鏈RNA，在線粒體和葉綠體基因轉錄后加工（包括編輯、剪接、剪切、降解和翻譯等）、調控細胞質雄性不育相關基因表達、參與調控胚胎形成和植物生長發育等方面發揮著重要作用[26]。研究表明，目前蘿卜中已發現的與育性有關的PPR蛋白有三種——PPR-A、PPR-B 和PPR-C，但只有PPR-B在恢復油菜雄性不育育性中起作用[14]。PPR-B是一種可溶性的線粒體膜融合蛋白，能通過某種直接或者間接的方式抑制orf138的mRNA在細胞質中的翻譯，從而使雄性不育系恢復育性[27]。

4 展望

盡管蘿卜Ogura類型雄性不育的研究最早起源于1968年，但是近10年來，關于orf138的研究報道更多地集中在甘藍、大白菜、油菜等作物上[28-34]，在蘿卜上的相關研究報道并不多。且對于蘿卜Ogura類型雄性不育的研究也主要局限于orf138蛋白積累與育性的關系、orf138與恢復基因PPR-B的關系以及影響絨氈層發育的相關基因等，orf138在蘿卜雄性不育中的作用機制仍然比較模糊，沒有定論。未來通過對Ogura類型雄性不育材料的創新，將進一步揭示orf138在蘿卜Ogura類型細胞質雄性不育中的作用機制，為蘿卜雄性不育系的雜交育種提供明確的理論支持和技術指導，同時提供新的雄性不育類型，加快蘿卜育種產業的發展。通過對orf138的研究，可增強蘿卜及其它利用orf138雄性不育基因作物保持系選育的針對性，使新發現的雄性不育材料盡快應用于生產，豐富蘿卜的雄性不育資源，避免細胞質單一給生產帶來的潛在風險。新不育源的發現，可增加蘿卜保持系選育的成功率，這對今后的雜交育種具有重要意義。

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