替米沙坦延緩大鼠視網膜衰老的作用及機制

朱江，施葉雯，周歆，姚倩，謝臣，康前雁

(1.西安市第四醫院眼科，陜西西安710004；2.南昌大學醫學院，江西南昌330031；3.西安交通大學第一附屬醫院眼科，陜西西安710061)

隨著年齡的增大，機體器官會發生不可逆的功能退變和衰老。視網膜屬于中樞神經系統的一部分，衰老對中樞神經系統的影響主要表現為皮質變薄、投射軸突減少、突觸丟失、結構改變、神經元密度和樹突減少以及功能退化等方面[1]。既往有研究證實，隨著年齡增加，大鼠視網膜各層結構變薄，視網膜神經節細胞數量減少，雙極細胞間突觸聯系減少，視細胞外節層增厚，而替米沙坦可使增厚的視細胞外節層變薄，從而延緩視網膜的衰老，但其潛在機制不明[2]。

視網膜衰老絕大多數的改變發生在光感受器細胞、視網膜色素上皮細胞和Bruch膜層面，這些改變包括細胞正常功能的喪失和細胞的丟失，研究顯示這些改變可能是由氧化應激、炎癥、慢性光損害及凋亡共同介導的[3]。替米沙坦是一種高效、長效、低毒的特異性血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體1(AT1)拮抗劑，是臨床高血壓治療的一線用藥。眼球局部也存在腎素-血管緊張素系統，且AngⅡ水平很高，其受體在視網膜中的分布主要以AT1受體為主，它們共同介導的生物學效應在視網膜病變中起著重要的作用[4]。

很大比例的老年人都在長期服用替米沙坦，但替米沙坦對衰老視網膜作用的相關研究鮮有報道。本研究通過建立大鼠衰老視網膜模型，檢測氧化應激相關蛋白Cu-Zn-SOD、NOX2、凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及p38 MAPK、κ基因結合核因子(nuclear factorκB，NF-κB)磷酸化水平的變化，探索替米沙坦延緩生理性視網膜衰老的潛在作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和模型制作健康無眼疾SD大鼠40只，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心[許可證號：SCXK(陜)2007-001]，3個月齡大小，體重200～250 g，SPF級，雌雄不限，應用隨機數表法將大鼠分為替米沙坦組和對照組，每組20只。飼養于18℃～22℃明暗各12 h的清潔級動物實驗室內，9個月齡時開始給予干預，替米沙坦組給予每天8 mg/kg替米沙坦灌胃，對照組給予等量的生理鹽水灌胃，至17個月齡[2]。本實驗已通過“西安交通大學動物實驗倫理委員會”批準。

1.2 實驗材料和試劑替米沙坦(德國Boehringer-Ingelheim公司)、Cu-Zn-SOD抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、NOX2抗體(美國Proteintech生物公司)、Bcl-2抗體(美國Proteintech生物公司)、Bax抗體(美國Proteintech生物公司)、SP-9001 HistostainTM-Plus Kit(北京中杉金橋生物技術有限公司)、ZLI-9017 DAB Kit(北京中杉金橋生物技術有限公司)、p38 MAPK抗體(美國CST生物公司)、p-p38 MAPK抗體(美國CST生物公司)、NF-κB抗體(美國CST生物公司)、p-NF-κB抗體(美國CST生物公司)、β-Actin抗體(北京全式金公司)、ECL發光液(美國Millipore公司)、PVDF膜(美國Millipore公司)

1.3 大鼠眼球樣本的提取100 g/L水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉17個月齡大鼠。0.9%生理鹽水200 mL經左心室灌注，灌注成功后摘取眼球，每只實驗大鼠的一側眼球用于HE和免疫組化染色，于4%多聚甲醛中固定24 h；另一側眼球取下后沿角鞏緣剪開，于4℃PBS中分離完整視網膜組織于滅菌EP管中，-80℃保存用于后續Western blot實驗。

1.4 組織病理學染色和免疫組織化學染色取固定好的組織常規石蠟包埋、連續切片，片厚4 μm。常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木素染色2 min；伊紅染色5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。另取切片，常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，將切片置于金屬抗原修復架上，浸入0.01 mol/L、pH=6.0的檸檬酸緩沖液中，微波中高火加熱5 min至沸騰，低火加熱12 min，修復完畢自然冷卻至室溫，3%H2O2去離子水孵育30 min，山羊血清37℃封閉1 h，分別滴加一抗：兔抗大鼠Cu-Zn-SOD抗體(1:400)，兔抗大鼠NOX2抗體(1:200)，兔抗大鼠Bcl-2抗體(1:100)，兔抗大鼠Bax抗體(1:100)，4°C過夜；復溫30 min，生物素標記的山羊抗兔IgG二抗37℃孵育40 min，辣根酶標記鏈霉卵白素室溫孵育30 min，DAB顯色劑顯色1 min，蘇木素復染細胞核2 min，PBS返藍5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察切片，利用Leica-Q550CW圖像采集與分析系統在40倍物鏡下進行圖像采集，隨機對每張切片上的視網膜選取5個視野，Image-Pro Plus 6.0分析每個視野下陽性表達部位的平均光密度。

1.5 Western blot取出視網膜組織，同一實驗分組中4只大鼠的視網膜組織混合，加入含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰浴下勻漿器充分勻漿裂解組織，4℃12 000 r/min離心20 min后取上清于新的滅菌離心管中，按體積比加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸蛋白樣品。每個樣品取10～20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別孵育一抗：p-38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，p-p38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，NF-κB兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，p-NF-κB兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，β-Actin小鼠抗大鼠多克隆抗體(1:3 000)，4℃過夜；復溫30 min，TBST洗脫一抗，滴加山羊抗兔和或山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗脫；ECL發光顯影，采集圖像，Image J軟件分析每個條帶的灰度值。

1.6 統計學方法應用SPSS13.0統計學軟件對實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示。對每組各個樣本的均數總體進行Shapiro-Wilk正態性檢驗，經Levene檢驗方差齊性后，采用獨立樣本t檢驗進行顯著性差異分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 替米沙坦對衰老大鼠視網膜形態的影響對照組大鼠視網膜各層結構排列稍顯紊亂，細胞形態大小不一，細胞數量減少；與對照組相比，替米沙坦組視網膜各層結構排列整齊，細胞形態基本一致，細胞丟失減少(見圖1)。與對照組相比，替米沙坦組大鼠視網膜厚度增加，差異有統計學意義(t=6.863，P=0.000)。

圖1 兩組大鼠視網膜病理組織學表現(HE×400)

2.2 替米沙坦對衰老大鼠視網膜內Cu-Zn-SOD、NOX2表達的影響替米沙坦組于神經節細胞層、內叢狀層、內核層、外叢狀層、光感受器細胞層的內節可見Cu-Zn-SOD強陽性表達，對照組Cu-Zn-SOD呈弱陽性表達。替米沙坦組及對照組的Cu-Zn-SOD均于內節表達相對明顯，外核層及外節未見表達。替米沙坦組較對照組的Cu-Zn-SOD表達強度增強，差異具有統計學意義(t=5.273，P=0.000)，見圖2、圖3。對照組于神經節細胞層、內叢狀層、內核層、外叢狀層、光感受器細胞層的內節可見NOX2強陽性表達，且NOX2于內節表達相對明顯，外核層及外節未見表達，與對照組相比，替米沙坦組NOX2的表達呈弱陽性。因此替米沙坦組較對照組的NOX2表達減少，差異具有統計學意義(t=5.446，P=0.000)，見圖2、圖3。

圖2 替米沙坦組及對照組大鼠視網膜Cu-Zn-SOD及NOX2的表達(HE×400)

圖3 替米沙坦組及對照組大鼠視網膜Bcl-2及Bax的表達(HE×400)

2.3 替米沙坦對衰老大鼠視網膜內Bcl-2、Bax表達及兩者比值的影響替米沙坦組和對照組于神經節細胞層、內叢狀層、內核層、外叢狀層、內節可見Bcl-2弱陽性表達，外核層也可見少量Bcl-2弱陽性表達。替米沙坦組與對照組Bcl-2的表達差異無統計學意義(t=0.189，P=0.853)，見圖3、圖4。替米沙坦組視網膜神經節細胞層、內叢狀層、內核層、外叢狀層、內節可見Bax強陽性表達，而對照組Bax的表達呈弱陽性。替米沙坦組較對照組的Bax表達增強，差異有統計學意義(t=2.729，P=0.016)，見圖3、圖4。替米沙坦組Bcl-2/Bax比值較對照組降低，差異具有統計學意義(t=-2.700，P=0.001)，見圖5。

圖4 兩組大鼠視網膜Cu-Zn-SOD、NOX2、Bcl-2及Bax的平均光密度

圖5 兩組大鼠視網膜的Bcl-2/Bax比值

2.4 替米沙坦對衰老大鼠視網膜內p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平的影響與對照組比較，替米沙坦組p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平均降低，差異有統計學意義(t=6.454，P=0.01；t=4.474，P=0.018)，見圖6。

圖6 兩組大鼠視網膜p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平的變化

3 討論

視網膜局部AngⅡ表達水平很高，其受體在視網膜中的分布主要以AT1受體為主。沙坦類藥物對諸多視網膜病變起保護作用：坎地沙坦對34%的2型糖尿病視網膜病變有治療作用；氯沙坦可減少缺氧視網膜內皮細胞數的增加，抑制早產兒視網膜病變中新生血管的生成；沙坦類藥物還具有劑量依賴性的降眼壓作用[5-8]。

隨著視網膜的衰老，視網膜平均厚度、神經節細胞數量、毛細血管數量、雙極細胞突觸結構體、感光細胞間連接、總蛋白等均較年輕時降低[9]。我們的既往研究表明，大鼠衰老后，視網膜總厚度及多層厚度均明顯變薄，視網膜各層厚度占視網膜總厚度的構成比基本不變；且替米沙坦處理衰老大鼠8個月后，可以顯著減少視網膜厚度的丟失，提示替米沙坦具有延緩視網膜衰老的作用，本研究的結果與既往研究結果一致[2]。且本研究通過檢測氧化應激相關蛋白Cu-Zn-SOD、NOX2、凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平進一步探討了替米沙坦對衰老視網膜的保護作用，發現替米沙坦作用衰老大鼠8個月后，可以增加Cu-Zn-SOD、Bax的表達，降低NOX2的表達及p38 MAPK、NF-κB的磷酸化水平，而替米沙坦對Bcl-2的影響不大。

Cu-Zn-SOD是內源性氧自由基清除劑的代表，能歧化超氧陰離子自由基，保護機體細胞和組織不受自由基的損害，延緩機體衰老過程。視網膜易于受到氧化刺激的破壞，而替米沙坦可以增加Cu-Zn-SOD的表達。NOX2是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的催化亞基之一，其在衰老大鼠的角膜和晶狀體上皮細胞中的表達明顯升高，提示其可以介導體內活性氧產生，并且參與機體衰老的病理生理過程[10-11]。替米沙坦作用大鼠后，可以減少視網膜內NOX2、增加Cu-Zn-SOD的表達，提示替米沙坦可能通過調控氧化應激對抗機體衰老。

細胞凋亡也參與細胞衰老的過程[12]。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的關鍵蛋白，兩者比值(Bcl-2/Bax)升高，則細胞趨向存活；反之則趨向凋亡[13]。本研究中，替米沙坦可通過增加Bax的表達使Bcl-2/Bax比值較對照組降低，說明替米沙坦可以促進衰老視網膜細胞的凋亡。而增加衰老視網膜的凋亡，有助于消除機體內老化和具有潛在性異常生長的細胞，從而保持機體處于穩態起著重要的作用[14]。

本研究還發現，替米沙坦對MAPK及NF-κB信號通路有抑制作用。機體衰老后，體內腎素-血管緊張素系統活性增高，AngⅡ及AT受體含量增加，活性氧的合成增加，其可通過激活MAPK信號傳導通路使NF-κB活化。NF-κB是參與一系列基因表達調控的關鍵性核轉錄因子。當血管周圍的周細胞內NF-κB被激活時，促凋亡因子Bax會過度表達，引起周細胞凋亡、血流動力學異常、血視網膜屏障破壞及視網膜毛細血管通透性增高[15]。本研究發現NF-κB被抑制時，促凋亡因子Bax仍過度表達，提示Bax可能受到非NF-κB依賴途徑的調控。而p38 MAPK信號通路也被證實參與氧化應激相關因子SOD和NOX2的調控。既往研究發現細胞衰老依賴于ROS激活p38 MAPK通路，p38 MAPK抑制劑能降低衰老相關基因p16的表達；且ROS較低的造血干細胞功能較強，p38 MAPK表達較低，p16基本不表達，提示在造血干/祖細胞的衰老中，p38 MAPK起著非常重要的作用[16-17]。且視網膜色素上皮細胞處于高糖環境時，p38 MAPK激活，并伴隨著SOD的表達減少；而NOX2則能促進p38 MAPKs的激活[18-19]。因此，替米沙坦對細胞凋亡及氧化應激的調控可能與MAPK及NF-κB信號通路有關。

綜上所述，替米沙坦可能通過p38 MAPK及NF-κB途徑，減輕局部視網膜氧化應激反應，增加大鼠衰老視網膜的細胞凋亡程度，消除視網膜內老化和具有潛在性異常生長的細胞，延緩大鼠視網膜的衰老。

[1] Zarbin MA.Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration[J].Arch Ophthalmol,2004,122(4):598-614.

[2] 王靜,康前雁.辛伐他汀和替米沙坦對大鼠視網膜衰老的延緩作用及其機制[J].中華實驗眼科雜志,2016,34(5):414-419.

[3] Nag TC,Wadhwa S.Ultrastructure of the human retina in aging and various pathological states[J].Micron,2012,43(7):759-781.

[4] Danser AHJ,Derkx FHM,Admiraal PJJ,et al.Angiotensin levels in the eye[J].Investigative Ophthalmology&Visual Science,1994,35(3):1008-1018.

[5] Chaturvedi N,Porta M,Klein R,et al.Effect of candesartan on prevention(DIRECT-Prevent 1)and progression(DIRECT-Protect 1)of retinopathy in type 1 diabetes:randomised,placebo-controlled trials[J].Lancet,2008,372(9647):1394-1402.

[6] Sjolie AK,Klein R,Porta M,et al.Effect of candesartan on progression and regression of retinopathy in type 2 diabetes(DIRECT-Protect 2):a randomised placebo-controlled trial[J].Lancet,2008,372(9647):1385-1393.

[7] Lonchampt M,Pennel L,Duhault J.Hyperoxia/normoxia-driven retinal angiogenesis in mice:a role for angiotensin II[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2001,42(2):429-432.

[8] Moravski CJ,Kelly DJ,Cooper ME,et al.Retinal neovascularization is prevented by blockade of the renin-angiotensin system[J].Hypertension,2000,36(6):1099-1104.

[9] Cavallotti C,Artico M,Pescosolido N,et al.Age-related changes in the human retina[J].Can J Ophthalmol,2004,39(1):61-68.

[10] Inumaru J,Nagano O,Takahashi E,et al.Molecular mechanisms regulating dissociation of cell-cell junction of epithelial cells by oxidative stress[J].Genes Cells,2009,14(6):703-716.

[11] 李彬,闞紅衛,武汪洋,等.老年大鼠角膜和晶狀體上皮細胞NADPH氧化酶表達的研究[J].安徽醫藥,2012,16(10):1425-1427.

[12] Arend N,Wertheimer C,Laubichler P,et al.Idebenone prevents oxidative stress,cell Death and senescence of retinal pigment epithelium cells by stabilizing BAX/Bcl-2 ratio[J].Ophthalmologica,2015,234(2):73-82.

[13] Li W,Jiang Y,Sun T,et al.Supplementation of procyanidins B2 attenuates photooxidation-induced apoptosis in ARPE-19 cells[J].Int J Food Sci Nutr,2016,67(6):650-659.

[14] Li W.Phagocyte dysfunction,tissue aging and degeneration[J].Ageing Res Rev,2013,12(4):1005-1012.

[15] Nagisa Y,Shintani A,Nakagawa S.The angiotensinⅡreceptor antagonist candesartan cilexetil(TCV-116)ameliorates retinal disorders in rats[J].Diabetologia,2001,44(7):883-888.

[16] Probin V,Wang Y,Zhou D.Busulfan-induced senescence is dependent on ROS production upstream of the MAPK pathway[J].Free Radic Biol Med,2007,42(12):1858-1865.

[17] Jang YY,Sharkis SJ.A low level of reactive oxygen species selects for primitive hematopoietic stem cells that may reside in the low-oxygenic niche[J].Blood,2007,110(8):3056-3063.

[18] Sidarala V,Veluthakal R,Syeda K,et al.A novel polysaccharide compound derived from algae extracts protects retinal pigment epithelial cells from high glucose-induced oxidative damagein vitro[J].Biochem Pharmacol,2015,95(4):301-310.

[19] Xie P,Fujii I,Zhao J,et al.Phagocyte-like NADPH oxidase(Nox2)promotes activation of p38MAPK in pancreaticβ-cells under glucotoxic conditions:Evidence for a requisite role of Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1(Rac1)[J].Biol Pharm Bull,2012,35(9):1447-1453.