天冬酰胺酶納米微球體外活性和穩定性

晏子俊， 李萬玉， 胡雪原， 何 丹， 謝江川， 張景勍

（重慶醫科大學 藥物高校工程研究中心，重慶400016）

天冬酰胺酶（Asparaginase，AAS）是降解天冬酰胺的重要酶[1]。天冬酰胺是機體合成蛋白質所需的重要氨基酸，某些腫瘤細胞（如白血病細胞和淋巴瘤細胞等）的天冬酰胺合成酶活性非常低，不能合成天冬酰胺，須依賴宿主供給來合成所需蛋白質[2]。AAS就是利用腫瘤細胞的這種機制，通過催化患者體內的天冬酰胺的降解，抑制腫瘤細胞中所需蛋白質的正常合成，從而使白血病細胞死亡[3-4]。但AAS存在穩定性差、容易被酶降解、半衰期短和活性低等缺點[6-7]，限制了其在臨床上的應用。

近來，文獻[8-11]報道的自組裝納米載體是一種新型的藥物載體。Ha等[10]采用自組裝的方法制備了載帶L-AAS的海藻酸-PEG/α-CD納米微球；Li等[11]采用自組裝方法制備了載帶葡萄糖氧化酶的羧甲基魔芋葡甘聚糖-PEG/α-CD納米微球。上述文獻報道的微球膜具有半滲透性和生物相似性，催化產物和酶的底物可順利通過微球膜，而被載帶的酶則不能自由通過，故拓寬了酶的最適溫度和最適pH，并提高了酶的穩定性。

作者依據上述思路，制備了載帶AAS的自組裝透明質酸-聚乙二醇 （Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）/羥 丙 基 -β - 環 糊 精（Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HPCD）納米微球（self-assembly HA -g -PEG/HPCD hollow nanospheres loaded with AAS，AHHPs），并初步考察了AHHPs的體外活性和體外穩定性，為臨床研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料、試劑 AAS：以色列Prospec公司，225 U/mg，純度≥ 96.0%；PEG：Sigma-aldrich公司，規格250 g；HA：曲阜市廣龍生物制品廠，純度＞99.0%；HPCD：成都格雷西亞化學技術有限公司，純度＞98.0%；HA-g-PEG：作者所在實驗室自制，批號20140519、20140521、20140526；Tris-HCl 緩 沖 液 ：50 mmol/L、pH 7.3，作者所在實驗室自配；其它試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；pH計：上海精密科學儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；UV-7504 PC紫外分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；Zetasizer Nano zs90激光粒度電位儀：英國馬爾文公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 AHHPs的制備 采用文獻[8-11]報道的自組裝方法制備AHHPs。具體如下：將適量溶有AAS的HA-g-PEG溶液緩慢滴加至HPCD溶液中，開始滴加時，溶液出現輕微的渾濁，即開始有納米微球形成，繼續一定溫度下磁力攪拌2 h后，即得AHHPs，批號為 20140520、20140523、20140528。

1.2.2 AHHPs的透射電鏡 取 AHHPs適量，用Tris-HCl緩沖液稀釋適當倍數后，用2%磷鉬酸染色后，滴于銅片上，在透射電鏡下觀察AHHPs的形態。

1.2.3 AHHPs粒徑和Zeta電位的測定 使用馬爾文粒度儀檢測AHHPs的粒徑和Zeta電位。取AHHPs適量，加入Tris-HCl緩沖液稀釋一定倍數后，測定AHHPs的粒徑和Zeta電位。

1.2.4 AHHPs包封率的測定 按照葡聚糖凝膠法[12]測定AHHPs的包封率。方法如下：制備過柱后的AHHPs，在595 nm波長下，測得吸光度A1。同法處理，測得未過柱的AHHPs的吸光度A2。由測得的吸收值A1和A2計算出1 mL AHHPs混懸液中制劑所含AAS的量W1和AHHPs混懸液中AAS總量W2，包封率按照如下公式計算：

包封率=（W1/W2）×100%

式中，W1為AHHPs混懸液中制劑所含AAS的量，W2為AHHPs混懸液中AAS總量W2。

1.2.5 最適溫度和最適pH 將天冬酰胺溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.3）中，分別在 20、30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中預熱 10 min 后， 在 37 ℃下按照瑪斯本-利斯通法[13]測定AHHPs和游離AAS的活性，由測定結果得到溫度-活性曲線。在50mmol/L Tris-HCl緩沖液體系中分別配制 pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 的天冬酰胺溶液，分別在37℃的水浴中預熱10 min后，測定AHHPs和游離AAS的活性，由測定結果得到pH-活性曲線。

1.2.6 熱穩定性的測定 取適量AHHPs和游離AAS 溶液，放置于 55 ℃的水浴中[5]，分別于 0、1、2、3、4、5 h時取出，測定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.7 貯存穩定性的測定 取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質量濃度為0.1 mg/mL）溶液，避光貯存于 4 ℃下，分別于 0、1、2、5、10、15、20、25、28 d 取出，測定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.8 酸堿穩定性的測定 取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質量濃度為0.3 mg/mL）溶液，分別用pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，8.0，9.5 的 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液稀釋3倍后，于37℃水浴中放置40 min后取出，測定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.9 抗胰蛋白酶水解能力的測定 取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質量濃度為0.2 mg/mL）溶液，分別加入等體積的0.2 mg/mL胰蛋白酶溶液，混勻后置于 37 ℃水浴，分別于 0、10、20、30、40、50、60 min時取出，測定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.10 血漿穩定性的測定 按照Saracino等[14]報道的方法配制體外模擬空白血漿。取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質量濃度為0.5 mg/mL）溶液，分別與5倍體積的體外模擬空白血漿混勻，于37℃下孵育 0、1、2、4、8、12、24、48、72 h 后，測定 AHHPs和游離AAS的活性。

2 結果與討論

2.1 AHHPs在透射電鏡下的形態

透射電鏡下觀察到AHHPs呈均勻分布的圓形或橢圓形，見圖1。

2.2 AHHPs的粒徑和Zeta電位

馬爾文激光粒度電位儀測得AHHPs的粒徑為（367.43±2.72）nm （見圖 2），Zeta 電位為 （-15.70±1.25）mV（見圖3）。說明AHHPs分布均勻，符合實驗要求。

圖1AHHPs的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy image of AHHPs

圖2AHHPs的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of AHHPs

圖3 AHHPs的Zeta電位分布圖Fig.3 Zeta potential distribution of AHHPs

2.3 AHHPs的包封率

用excel 2007進行數據統計，統計結果用均數±標準差表示。通過對3批AHHPs制劑的包封率進行平行測定，結果得到AHHPs的包封率為（66.03±3.81）%。

2.4 最適溫度

AHHPs的最適溫度為50℃，游離AAS的最適溫度為60℃，見圖4。20～50℃時AHHPs和游離AAS的活性均隨溫度的升高而逐漸增加；60～80℃時AHHPs和游離AAS的活性則隨溫度的升高而逐漸降低；50～60℃時 AHHPs的活性幾乎相等，且AHHNPs在20～80℃時的活性均大于游離AAS。

圖4 AHHPs和游離AAS的最適溫度（n=3）Fig.4 Optimal temperature of AHHPs and free AAS（n=3）

2.5 最適pH值

AHHPs的最適pH為7.0，游離AAS的最適pH為 7.5，見圖 5。由圖 5 可知，pH 5.5～7.0 時，AHHPs和游離AAS的活性均隨pH值升高而逐漸增加；pH 7.5時，游離AAS的活性雖進一步增加，之后則開始下降；pH 7.0～9.5時，AHHPs的活性雖在一直下降，但pH 7.0～8.0時，AHHPs的活性均大于游離AAS在最適pH 7.5時的活性，說明AHHPs最適pH的范圍較游離 AAS有所變寬，且 pH 5.5～9.5時AHHPs的活性均大于游離AAS。

圖5 AHHPs和游離AAS的最適pH值（n=3）Fig.5 Optimal pH of AHHPs and free AAS（n=3）

2.6 熱穩定性的測定

AHHPs和游離AAS的熱穩定性測定結果見圖6。由圖6可知，5 h時AHHPs仍保留有55%以上的活性，而游離AAS在相同條件下的熱穩定性較差；3 h時游離AAS已完全失活，說明AHHPs的熱穩定性明顯好于游離AAS。

2.7 貯存穩定性的測定

AHHPs和游離AAS的貯存穩定性測定的結果見圖7。由圖7可知，AHHPs在4℃保存28 d后，AHHPs的活性保留值仍為45%，而游離AAS的活性保留值則降為20%，且AHHPs在4℃指定保存時間點的活性均比游離AAS好，說明AHHPs的貯存穩定性比游離AAS好。

圖6 AHHPs和游離AAS的熱穩定性（n=3）Fig.6 Thermal stabilities of AHHPs and free AAS（n=3）

圖7 4℃下AHHPs和游離AAS貯存穩定性的測定（n=3）Fig.7 Storage stabilities ofAHHPsandfreeAAS incubated at 4 ℃（n=3）

2.8 酸堿穩定性的測定

AHHPs和游離AAS的酸堿穩定性測定結果見圖8。由圖8可知，pH 6.5～8.5時，AHHPs的活性保留值約為95%，游離AAS的活性保留最大值僅為85%，即pH 6.5～8.5時，AHHPs的活性均大于游離AAS在最大活性pH 7.5時的活性；pH 5.5～9.5時，AHHPs的活性均比同一pH值游離AAS的活性高，說明HHNPs極大地提高了AAS抗外界環境酸堿變化能力。

圖8 AHHPs和游離AAS酸堿穩定性的測定（n=3）Fig.8 pH stabilities of AHHPs and free AAS（n=3）

2.9 抗胰蛋白酶水解能力的測定

AHHPs和游離AAS的抗胰蛋白酶水解能力測定結果見圖9。AHHPs在20 min時保留有80%左右的活性，60 min時其保留活性值仍為30%以上。相反，游離AAS的活性則呈快速下降的趨勢，20 min時已降到了60%左右，50 min時已全部失活。說明AHHPs的抗胰蛋酶水解能力明顯強于游離AAS。

圖9AHHPs和游離AAS抗胰蛋白酶水解能力的測定（n=3）Fig.9 Proteolytic stabilities of AHHPs and free AAS（n=3）

2.10 血漿穩定性的測定

AHHPs和游離AAS的血漿穩定性測定的結果見圖10。由圖10可知，8 h時AHHPs的活性保留值為80%以上，72 h時AHHPs的活性保留值約為20%；而游離AAS在8 h時的活性保留值約為40%，48 h時游離AAS已全部失活。AHHPs的最高活性點為2 h時，整個過程中其活性的變化趨勢是先降低再升高再降低；而游離AAS的最高活性點為0 h時，整個過程中其活性一直呈下降趨勢。說明AHHNPs在模擬血漿中的穩定性明顯比游離AAS好。

3 結 語

在最適溫度和最適pH實驗中，AHHPs的最適溫度和最適pH均與游離AAS的不同，Ha等[12]制備的L-AAS納米微球和游離L-AAS也表現出不同的最適溫度與最適pH。相對于游離AAS，AHHPs的最適溫度和最適pH的改變及活性的增強可能是由于：1）AHHPs的制備過程中，自組裝納米微球包裹AAS的同時，AAS的結構發生了改變；2）AAS與自組裝納米微球的膜通過某種方式相互作用穩定了酶的活性[15]。一般情況下，pH及溫度過低或過高都可以影響到酶的穩定性，從而使其發生不可逆的破壞，溫度、pH與酶發揮最大活性密切相關，酶在其最適溫度和最適pH時，其活性最高，酶促反應速度也最快，而小于或大于這個范圍，其活性都會有所降低。

圖10 AHHPs和游離AAS血漿穩定性的測定（n=3）Fig.10 Plasma stability of AHHPs and free AAS（n=3）

AHHPs的熱穩定性、貯存穩定性、酸堿穩定性、抗胰蛋白酶水解能力和血漿穩定性均明顯好于AAS，原因可能是酶蛋白中的一些高級結構或蛋白質中的反應基團裸露于外部環境中，過低或過高的溫度、過堿或過酸的環境、貯存的時間、酶的水解及血漿的存在均使得酶分子的性質和內部結構有所改變，而導致酶活力的改變甚至喪失。

本研究得到的自組裝HA-g-PEG/HPCD納米微球是一種新型的藥物載體，將AAS制備成AHHPs后，減少了外界環境變化對酶分子構象的影響，并對酶蛋白具有一定的保護作用，因而使得AAS的穩定性獲得了提高。

[1]PIETERS R，HUNGER S P，BOOS J，et al.L-asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia：a focus on Erwinia asparaginase[J].Cancer，2011，117（2）：238-249.

[2]GRUSON B，VAIDA I，MERLUSCA L，et al.L-asparaginase with methotrexate and dexamethasone is an effective treatment combination in blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasm[J].Br J Haematol，2013，163（4）：543-545.

[3]WYPIJ J M，PONDENIS H C.E.coli-derived L-asparaginase retains enzymatic and cytotoxic activity in vitro for canine and feline lymphoma after cold storage[J].Vet Med Int，2013，2013：786162.

[4]KUBOI R，YOSHIMOTO M，WALDE P，et a1.Refolding of carbonic anhydrase assisted by 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine liposomes[J].Biotechnol Prog，1997，13：828-836.

[5]KOTZIA G A，LABROU N E.Engineering thermal stability of L-asparaginase by in vitro directed evolution[J].FEBS J，2009，276（6）：1750-1761.

[6]IKEUCHI H，AHN Y M，OTOKAWA T，et al.A sulfoximine-based inhibitor of human asparagines synthetase kills L-asparaginase-resistant leukemia cells[J].Bioorg Med Chem，2012，20（19）：5915-5927.

[7]HAFSA K E，WU W T，LIU J J，et al.The E.coil L-asparaginase was modified with activated dextran and PEG-2[J].Pharmaceutical Biotechnology，1997，4（2）：118-121.（in Chinese）

[8]MENG X W，HA W，CHENG C，et al.Hollow nanospheres based on the self-assembly of alginate-graft-poly （ethylene glycol）and α-cyclodextrin[J].Langmuir，2011，23：14401-14407.

[9]HA W，FAN M M，ZHANG S，et al.Self-assembly of chitosan-g-PEG and α-cyclodextrin into hollow spheres in aqueous solution[J].J Control Release，2011，152 Suppl 1：e204-205.

[10]HA W，MENG X W，LIQ，etal.Self-assemblyhollow nanosphere forenzyme encapsulation[J].Soft Matter，2010，6：1405-1408.

[11]LI Q，XIA B，BRANHAM M，et al.Self-assembly of carboxymethyl konjac glucomannan-g-poly （ethylene glycol） and（α-cyclodextrin） to biocompatible hollow nanospheres for glucose oxidase encapsulation[J].Carbohydrate Polymers，2011，86：120-126.

[12]WANG Hong，WU Wutong，GU Xueqiu.Preparation of proliposomes and the determination of encapsulation of recombinant-L-asparaginase[J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University，1999，16（4）：235-238.（in Chinese）

[13]施特爾馬赫.酶的測定方法[M].錢嘉淵譯.北京：中國輕工業出版社，1992：85-88.

[14]SARACINO M A，MARCHESELLI C，SOMAINI L，et al.Simultaneous determination of disulfiram and bupropion in human plasma of alcohol and nicotine abusers[J].Anal Bioanal Chem，2010，398（5）：2155-22161.