煙葉落黃過程中煙堿代謝規律及相關基因表達分析

張震彪，李 偉，杜詠梅，張海良，劉 成，李曉旭，郭永峰*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

煙堿是重要的氮素化合物，其含量高低直接影響煙葉品質及香味，培育適宜煙堿含量的煙草品種，提高煙葉質量、降低卷煙制品對健康的危害一直是生產上追求的目標[1]；了解煙葉落黃過程中煙堿代謝規律及基因表達變化，對改良煙草品質、指導煙草農業生產具有重要意義[2]。

煙堿是生物堿中最主要成分，其干重占90%以上[3]，煙堿合成部位為植物根部，利用維管組織運輸至葉片中，儲存于植物葉片的液泡[4]。目前煙堿合成機制已基本闡明，包括吡咯環和吡啶環的形成、兩環的縮合。吡咯環和吡啶環合成較復雜，需經歷多個酶促反應，如精氨酸脫羧酶（argininedecarboxylase,ADC)催化精氨酸形成腐胺[5]，腐胺在腐胺-N-甲基轉移酶（putrescineN-methyltransferase,PMT）作用下形成N-甲基腐胺（N-methyltransferase）[6]，N-甲基腐胺氧化酶（N-methyltransferase oxidase，MPO）氧化N-甲基腐胺形成4-甲氨基丁醚[7]等，而吡啶環生成需要喹啉酸合成酶（quinolinate synthase,QS）、喹啉酸磷酸核糖基轉移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase,QPT)的參與[5,8]，最終兩環在黃酮還原酶A622和小檗堿橋連酶BBL的作用下縮合形成煙堿[9-10]，目前兩環縮合的機制仍未知，參與縮合的煙堿合成酶基因尚未被克隆。

煙葉成熟衰老過程中，煙堿發生去甲基化而轉化成降煙堿，其中CYP82E4v1是該過程的重要調控因子[11]，進一步研究證實CYP82E5v2、CYP82E2和CYP82E10也參與此反應[12]，不同的是CYP82E4v1在衰老組織中表達活躍，而CYP82E5v2主要在未衰老的組織中表達。衰老后期煙葉中的煙堿含量升高，其中JAT1、MATE和NUP1蛋白發揮重要轉運功能，JAT1、MATE主要位于液泡膜上，負責將胞質內煙堿轉運至液泡內，而NUP1定位于質膜，主要運輸胞質外煙堿至胞內，此外NUP1具有很強的特異性，不能轉運新煙堿和降煙堿[13]。煙堿合成過程受植物激素調控，如茉莉酸、生長素、乙烯等[6]，茉莉酸能夠激活煙堿合成基因的表達，而生長素和乙烯是煙堿合成的負調控因子，抑制煙堿的合成；同時，COI1和JAZ1以及肌醇戊基磷酸分子組成的茉莉酸受體復合體能夠感知并應答茉莉酸信號，改變煙堿合成基因的轉錄活性，影響煙堿合成[14]；此外，轉錄因子ERF32、ORC1、bHLH1/2和MYC2等通過介導JA途徑也參與調控煙堿代謝[15-17]。

煙草作為生物學研究的模式植物，其煙堿合成、遺傳調控及轉運機制已基本闡明，代謝途徑相關基因、重要調控因子和轉運蛋白均已被克隆和鑒定，而煙葉落黃衰老過程中煙堿代謝變化及相關基因表達規律尚未明確；本試驗以普通煙草紅花大金元為材料，選取打頂后15、25、35、45、55、65、75、85 d中部葉片，分析打頂后不同衰老時期煙葉生物堿的含量變化；利用該樣品已測定的轉錄組數據，分析煙堿代謝相關基因表達模式；對15、45、55、75 d的樣品進行煙堿代謝相關基因定量分析，驗證轉錄組數據；為進一步解析煙草煙堿代謝調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試材料：普通煙草（Nicotiana tabacum）紅花大金元，由中國農業科學院煙草研究所種質資源中心提供。

試驗試劑：RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Fast qPCR Mix均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 2013年3月溫室播種，4片真葉時假植，8片真葉移栽至大田，以中部葉（自下而上第9～10片）為研究對象，煙株打頂后15 d第1次取樣，以后每隔10天取樣1次，共計8次，分別代表不同衰老程度的煙草葉片。取樣時選擇生長狀態一致的植株，在相同葉位每株僅取1次，選取12個單株為一次樣品采集，每3株混合為一個樣本，4次生物學重復。收取的每個葉片以主葉脈為界一分為二，分別用于生物堿含量測定和RNA提取，液氮速凍后-80℃保存。

1.2.2 生物堿含量測定 將煙草葉片液氮研磨至細粉末狀，冷凍干燥48 h，采用氣相色譜-質譜聯用法測定樣品中生物堿的含量，主要包括煙堿、去甲基煙堿、新煙草堿、麥斯明，以國標為參照進行。

1.2.3 轉錄組分析煙堿代謝相關基因 查閱相關文獻，在NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索煙堿代謝相關基因序列，分別比對中國煙草基因組數據庫（未公開發表），提取基因ID；根據本實驗室已有的煙草葉片衰老轉錄組數據，從差異表達基因（|log2|≥1，p≤0.05）中篩選ID號，結果見表1，提取煙堿代謝相關基因轉錄組數據，利用熱圖繪制軟件GSP，Heml繪制基因表達熱圖，將表達數據可視化。（注：實驗室已有的轉錄組數據即為本次試驗所用材料的轉錄組測序結果，轉錄組測序由華大基因完成）。

1.2.4 Real-Time PCR驗證煙堿代謝基因表達數據煙草葉片總RNA提取，參照寶生物RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）試劑盒說明書進行，凝膠電泳和超微量分光光度計檢測RNA的質量和濃度，寶生物提供的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)用于RT-PCR反應，將合成的cDNA稀釋10倍，常規PCR檢測cDNA質量，選取高質量cDNA為模板，定量分析煙堿代謝基因表達變化。

利用Premier Prime5.0軟件設計煙堿代謝相關基因的定量PCR引物（表1）。選用打頂后15、45、55、75 d葉片cDNA為模板，ABI 7500型實時熒光定量PCR儀進行Real-Time PCR反應，3次技術重復，以打頂后15 d的葉片為單位1，采用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量，SPSS 22.0進行方差分析。

2 結果

2.1 煙草不同衰老時期葉片中生物堿含量分析

不同衰老時期葉片中生物堿含量（煙堿、去甲基煙堿、新煙草堿、麥斯明）如圖1所示。可以看出，煙草衰老成熟過程中，葉片中生物堿各組分呈現上升趨勢，包括煙堿、新煙草堿、去甲基堿、麥斯明；衰老后期（75或85 d時），新煙草堿含量上升最明顯，增加了123.7%，煙堿、去甲基堿含量也有明顯提高，分別增加54.2%和42.7%，而麥斯明含量只有18.5%的提高，以上結果顯示葉片中生物堿含量隨著煙葉成熟衰老逐步積累。

2.2 葉片煙堿代謝基因表達分析

根據轉錄組測序結果，檢索煙堿代謝相關基因表達數據，利用相應的生物信息學軟件繪制基因表達差異圖（圖2）。共檢索到43個煙堿代謝相關基因，涉及煙堿合成、降解、轉運、以及遺傳調控等過程。圖2顯示，隨著煙葉成熟衰老，煙堿降解相關基因CYP82E2、CYP82E4上調表達，其中CYP82E2表達量上升6.2倍，CYP82E4上升2.9倍，而CYP82E10、CYP82E5v2表達量變化不大；煙堿合成基因主要包括ADC、ODC、BBL、MPO、QS、SPDS及其同源基因，其中BBL2表達量上調2.9倍，ODC2上調2.7倍，ADC1略上調，其他基因表達變化不明顯；煙堿轉運相關基因分別是JAT1、MATE2、NUP1，其中JAT1在衰老后期上調最明顯，表達量提高2.6倍，NUP1的表達模式類似于MATE2，在65 d時最高；煙堿代謝調控基因較多，包括COI、MYC、ORC、JAZ、MTHFR1、ERF32及其同源基因，其中COI2、COI3、MYC2、MYC3、JAZ1上調表達，而JAZ1、MYC2上調最明顯，約2.3倍，下調基因有MTHFR1、ORC3，其余基因未有明顯變化。圖2中基因表達變化說明煙堿代謝是通過多個基因協同調控實現的，相關基因表達變化趨勢同衰老葉片中煙堿、降煙堿含量變化規律基本一致。

表1 引物目錄Table1 Primers

圖1 打頂后不同時期葉片中的生物堿含量Fig.1 Alkaloid contents in leaves at different time points after topping

圖2 煙堿代謝相關基因的表達數據分析Fig.2 Expression of genes related to nicotine metabolism

2.3 Real-Time PCR表達數據分析

選取煙堿代謝關鍵基因（表1），以打頂后15、45、55、75 d葉片cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR，驗證轉錄組數據，結果如表2所示。定量PCR結果顯示，調控基因CYP82E4、CYP82E2在葉片衰老后期上調表達，75 d時表達量增加10.7倍；轉運蛋白基因JAT1在55 d時上調8.87倍，而NUP1在45 d時上調3.37倍，可能這一時期煙堿運輸活性最強；合成基因ADC1、ODC2、BBL2也呈現上調趨勢，且55 d時表達量達分別提高2.41、16.2和6.49倍，預示著葉片器官也可能參與了煙堿的合成；調控基因COI1、MYC3在55 d時表達量上升至15 d的13.8倍和3.77倍，JAZ1、MYC2在整個衰老時期上調表達，75 d時表達量分別增加3.5倍和4.55倍，MTHFR1下調顯著，75 d時表達量下降到原來的0.238倍，而ORC1變化不明顯；以上定量分析與本試驗轉錄組測序結果基本一致，表明轉錄組測序結果能夠真實地反映煙堿代謝相關基因的表達情況，這為煙堿代謝功能基因的發掘提供了有利的參考。

表2 煙堿主要代謝基因qRT-PCR驗證分析Table 2 Real-Time PCR verification of gene expression in nicotine metabolism

3 討論

煙堿合成的根特異性機制認為，根部器官是煙堿合成的唯一部位，其他組織器官不具備合成煙堿的能力[5]；在衰老成熟過程中，參與煙堿轉運的蛋白基因JAT1、NUP1表達上調，NUP1將根部的煙堿運輸至葉片器官，再由JAT1轉運至液泡內，從而使葉片中的煙堿含量增加，但轉錄組測序及定量驗證結果顯示，ADC1、ODC2、BBL2等煙堿合成基因在葉片衰老過程中表達水平明顯提高，暗示葉片中有可能存在某幾個煙堿合成催化反應，如通過ADC1、ODC2促進吡咯環生物合成或BBL2催化兩環的縮合途徑實現煙堿含量持續增加，促進成熟葉片中的煙堿合成，但衰老葉片中是否存在煙堿合成還需進一步驗證；生物堿含量分析結果表明，除煙堿外，其他生物堿及代謝中間產物如新煙草堿、降煙堿、麥斯明等在衰老葉片中不斷積累，而轉錄組和定量PCR分析結果顯示，煙堿轉化基因CYP82E2、CYP82E4表達持續增加，推測煙堿向降煙堿的轉化主要通過CYP82E2、CYP82E4途徑來實現。

煙堿代謝是一個極其復雜的生物學過程，多個因子協同調節基因變化最終影響葉片中的煙堿含量。COI1蛋白能夠響應JA信號，在26S蛋白酶體的作用下靶向降解JAZ蛋白，JAZ蛋白表達水平下降，從而激活JA響應基因的轉錄[14]，但轉錄組測序和定量驗證結果顯示，衰老后期JAZ1上調表達，說明衰老介導JAZ1調控煙堿合成途徑不同于JA，其調控機制有待于進一步研究；MTHFR1通常作為CYP82E4的轉錄抑制因子調控CYP82E4的轉錄[6]，試驗結果顯示，葉片衰老過程中，MTHFR1表達量降低，對CYP82E4的抑制作用減弱，從而使CYP82E4轉錄水平提高，有利于煙堿向降煙堿方向的轉化，這與之前的研究基本一致；ORC1過表達能提高煙堿的含量[16]，但ORC1調控煙堿合成的機制尚不清楚，目前有研究指出ORC1響應MeJA信號途經，通過磷酸化途徑激活煙堿合成基因表達，定量分析結果顯示，ORC1在整個衰老過程中表達略微下調，表明除了轉錄水平外，衰老介導ORC1調控煙堿合成途徑可能也有磷酸化過程的參與。

植物體內的煙堿含量受環境因素影響，在一定范圍溫度能促進葉片中煙堿積累[18]，肖金香等[19]對氣候生態因素影響烤煙品質的研究中發現，氣溫每上升1℃，煙堿可提高3.59 g/kg；金云峰等[18]研究發現，成熟期生物堿的積累水平與生長溫度呈正相關關系，溫度上升能促進煙堿向葉片中的轉移；與此相一致地，本試驗發現自然衰老的煙葉中煙堿含量穩定上升，推測這一過程可能與植物所受溫度有關。不同栽培措施如打頂抹杈、施肥等對煙堿含量也有很大影響[2,20-21]，生產上打頂能促進煙堿向葉部的轉移[22]，而氮肥能極大地提高煙堿的生物合成。不同的環境因素和栽培措施影響煙堿代謝的機制目前尚未弄清，猜測可能影響了煙堿合成或轉運的關鍵酶基因表達而改變葉片煙堿含量，這一假設需要進一步驗證。

4 結論

試驗結果表明，煙草葉片成熟過程中生物堿含量不斷增加，包括煙堿、去甲基煙堿、新煙草堿、麥斯明；而煙堿作為生物堿最主要的部分，其含量在衰老過程中不斷提高。與煙堿含量增加相符的是，在煙葉衰老過程中，一些與煙堿運輸相關的蛋白基因上調表達，例如JAT1、NUP1等。同時進入衰老期后，葉片中煙堿合成代謝基因表達量增加，例如ADC1、ODC2、BBL2及其同源基因，暗示著衰老后期葉片中可能存在煙堿合成。調控煙堿代謝相關基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3表達上調，MTHFR1下調，表明葉片中的煙堿代謝是由多個因子協同調節完成的，存在復雜的調控網絡機制。本研究通過分析煙草衰老葉片煙堿代謝相關基因表達情況，探究煙葉成熟衰老過程煙堿代謝變化規律，為生產上改良煙葉品質、選育優良品種及減輕卷煙制品對健康的危害提供了理論參考。

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