采用磁共振示蹤法探討大鼠腦細胞間隙內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運清除規(guī)律

李學(xué)義，王 偉，韓鴻賓，和清源，石春彥，王艾博，滕 澤

(1.長慶油田職工醫(yī)院影像科，陜西 西安 710201；2.佛山市第一人民醫(yī)院 中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院MR室，廣東 佛山 528000；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科 磁共振設(shè)備與技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100191；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，北京 100029)

腦細胞間隙(extracellular space, ECS)是腦細胞賴以生存的最直接空間，長期被認為僅有細胞間黏附與支撐的物理作用。近年來，研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，ECS在細胞遷移、信息傳遞、細胞基本代謝與功能實現(xiàn)中均發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。此外，經(jīng)ECS輸送藥物為腦病治療提供了新的路徑[4]。研究[5]顯示，較傳統(tǒng)的靜脈或口服給藥，經(jīng)ECS給藥技術(shù)療效更好。因此，對ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運規(guī)律的研究在腦科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床腦病治療方面均有重要意義。磁共振示蹤法是研究ECS的新技術(shù)，其不但可實現(xiàn)全腦范圍ECS物質(zhì)轉(zhuǎn)運的可視化，也可測量ECS內(nèi)轉(zhuǎn)運參數(shù)(如有效擴散系數(shù)和半衰期等)[6]。本研究采用磁共振示蹤法探討不同外界刺激下相關(guān)腦區(qū)ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將32只成年雄性SD大鼠(體質(zhì)量250～300 g)隨機分為4組，包括尾狀核-對照組、丘腦-對照組、尾狀核-運動組和丘腦-疼痛組，每組8只。本實驗由北京大學(xué)健康中心批準(批準號LA2012-016)。

1.2 方法 檢查過程中使用電熱墊，使實驗鼠體溫維持在(38.0±0.5)℃。對大鼠腦進行MR掃描獲得基準圖像。

本研究發(fā)現(xiàn)雖然大鼠尾狀核和丘腦的解剖位置緊密相鄰，但兩者ECS空間被隔斷，其內(nèi)的物質(zhì)在兩者之間不能進行跨區(qū)域轉(zhuǎn)運，且Gd-DTPA的t1/2差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示大鼠腦內(nèi)ECS具有分區(qū)分隔的特性，與既往認為腦ECS是高度聯(lián)通的空間、物質(zhì)在其內(nèi)的擴散方向是隨機的理論[9]相矛盾；其生理學(xué)和解剖學(xué)機制尚不清晰，值得進一步研究。

對尾狀核-對照組和尾狀核-運動組均采用2%的異氟烷和氧氣混合物的氣體麻醉。對尾狀核-對照組全程麻醉，并每隔30 min進行1次MR掃描，至Gd-DTPA對丘腦-對照組所致的高信號消失為實驗結(jié)束；對尾狀核-運動組在注射對比劑后即刻進行MR掃描，復(fù)蘇自主運動20 min后再次麻醉，每隔30 min進行MR掃描至實驗結(jié)束。和丘腦-疼痛組采用腹腔內(nèi)注射戊巴比妥、乙醇、水合氯醛、硫酸鎂和丙二醇(0.3 ml/kg體質(zhì)量)的復(fù)合麻醉。對丘腦-對照組全程麻醉，并每隔30 min進行1次MR掃描；對丘腦-疼痛組在注射對比劑后即刻進行MR掃描，然后在大鼠翻正反射陽性時給予前爪電刺激，刺激參數(shù)：電流強度5 mA，每次電刺激持續(xù)時間15 s、間隔5 s、持續(xù)10 min，刺激后再次給予腹腔麻醉，進行MR掃描至實驗結(jié)束。

圖1ECS內(nèi)的示蹤劑分布 A.尾狀核-對照組，軸位示示蹤劑向同側(cè)皮層轉(zhuǎn)運，未向內(nèi)后方丘腦轉(zhuǎn)運; B.丘腦-對照組，軸位示示蹤劑在原位清除，亦未向尾狀核區(qū)轉(zhuǎn)運;相比尾狀核，丘腦區(qū)示蹤劑轉(zhuǎn)運清除顯著加速

圖2 尾狀核ECS中Gd-DTPA的分布 A.尾狀核-運動組; B.尾狀核-對照組 軸位示兩組Gd-DTPA在尾狀核ECS內(nèi)清除過程相似

圖3丘腦ECS中Gd-DTPA的分布 A.丘腦-疼痛組；B.丘腦-對照組 冠狀位示Gd-DTPA在丘腦-疼痛組ECS內(nèi)的清除顯著減慢

采用Siemens Trio 3.0T MR掃描儀，8通道腕關(guān)節(jié)線圈，采用T1W三維磁化準備快速采集梯度回波序列，TR 1 500 ms，TE 3.7 ms，翻轉(zhuǎn)角12°，翻轉(zhuǎn)時間900 ms，層厚0.5 mm，視野267 mm，像素0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm，采集時間290 s。

文中闡述了折臂式鐵鉆工底座回轉(zhuǎn)機構(gòu)工作原理為：電動機通過驅(qū)動輪帶動行星輪將扭轉(zhuǎn)力傳遞到回轉(zhuǎn)軸承上進而實現(xiàn)了鐵鉆工整體的旋轉(zhuǎn)運動，完成鉆井上卸鉆柱絲扣的工藝要求，并得出了以下結(jié)論：

固始雞在雞舍內(nèi)養(yǎng)殖至120 d，雞胸肉和腿肉中無抗養(yǎng)殖與有抗養(yǎng)殖比較，總氨基酸無差異，呈鮮味氨基酸、必需氨基酸無抗養(yǎng)殖高于有抗養(yǎng)殖。至180 d，雞胸肉中總氨基酸無抗養(yǎng)殖略高于有抗養(yǎng)殖，但差異不顯著；呈鮮味和必需氨基酸無抗養(yǎng)殖低于有抗養(yǎng)殖，非必需氨基酸則無抗略高，雞腿肉中差異不明顯。肝臟中總氨基酸、呈鮮味、必需和非必需氨基酸有抗養(yǎng)殖組更高。

1.3 圖像分析 采用磁共振設(shè)備與技術(shù)北京市重點實驗室開發(fā)的基于Matlab的軟件，將圖像自動進行剛性轉(zhuǎn)化、相似度檢測、插值和自適應(yīng)優(yōu)化，與基準圖像進行對減后獲得Gd-DTPA所致的信號強度增量ΔSI，將ΔSI線性變換為濃度后，計算示蹤劑在ECS清除的半衰期(t1/2)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，t1/2的比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

將研究區(qū)含水層結(jié)構(gòu)概化為2層，第一層對應(yīng)第四系松散層，地下水類型為孔隙水；第二層為巖溶含水層,地下水類型為潛水。其邊界條件概化為：北側(cè)為定流量邊界，西側(cè)和東側(cè)為隔水邊界，南側(cè)為定水頭邊界。廢渣填埋場是本次評價的主要污染源，污染遷移模擬過程中將這個污染源作為排放面源進行模擬。研究區(qū)總面積約為5.06 km2，研究區(qū)地下水流系統(tǒng)概化為非均質(zhì)各向異性三維穩(wěn)定流。

2 結(jié)果

腦ECS占活體腦容積的20%，但由于ECS是直徑為38～64 nm的不規(guī)則形納米管道系統(tǒng)，且在離體狀態(tài)下ECS會發(fā)生顯著變化。因此，現(xiàn)有常規(guī)診斷用成像系統(tǒng)均無法直接采集到ECS的結(jié)構(gòu)信息。目前，對在體腦ECS結(jié)構(gòu)和功能的精準測量主要依靠電化學(xué)和光學(xué)示蹤法，通過研究示蹤分子在ECS內(nèi)的轉(zhuǎn)運規(guī)律，推測ECS的生物物理屬性，但均存在測量深度和范圍的限制[7]。因此，本實驗室設(shè)計一種新的示蹤技術(shù)，通過對深部組織細胞間隙的成像，實現(xiàn)全腦范圍ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的多維可視化，并通過圖像后處理和數(shù)理建模定量分析ECS相關(guān)理化參數(shù)(如紆曲度)和物質(zhì)在ECS內(nèi)的轉(zhuǎn)運參數(shù)(如有效擴散系數(shù)和t1/2)。該技術(shù)的原理是將磁性示蹤劑Gd-DTPA立體定向?qū)隕CS，Gd-DTPA可縮短2.41～2.5埃距離內(nèi)水分子的弛豫時間，呈高信號；通過監(jiān)測高信號的范圍即可推測Gd-DTPA擴散的范圍，利用MR多角度成像的優(yōu)勢，可實現(xiàn)ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的三維可視化；同時通過圖像處理和數(shù)學(xué)的方法，將MR圖像的信號強度變化轉(zhuǎn)化為示蹤劑濃度的變化，建立濃度—時間—位置的相關(guān)函數(shù)，計算示蹤劑轉(zhuǎn)運和清除有關(guān)的參數(shù)[8]。

3 討論

尾狀核ECS內(nèi)的Gd-DTPA可轉(zhuǎn)運至鄰近皮層區(qū)，丘腦ECS內(nèi)Gd-DTPA的轉(zhuǎn)運局限于原位，未觀察到向鄰近區(qū)域進行跨區(qū)域轉(zhuǎn)運，見圖1。尾狀核-對照組、丘腦-對照組Gd-DTPA的t1/2分別為(104.30±54.12)min和(49.93±2.11)min，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.839,P<0.05)。尾狀核-運動組Gd-DTPA的t1/2為(113.42±47.32)min，與尾狀核-對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.359,P>0.05，圖2)。丘腦-疼痛組的Gd-DTPA的t1/2為(109.40±10.33)min，與丘腦-對照組比較，Gd-DTPA的清除顯著減慢(t=15.954,P<0.05；圖3)。

將大鼠保定于立體定位系統(tǒng)，暴露其前囟，根據(jù)尾狀核和丘腦坐標進行穿刺(尾狀核坐標為前囟前1.0 mm、前囟旁3.5 mm、深度5.0 mm；丘腦坐標為前囟后3 mm、前囟旁2 mm、深度6 mm)，將2 μl稀釋的Gd-DTPA(10 mmol/L)通過微量注射針和自動藥物注射泵注射至尾狀核和丘腦區(qū)，速率0.2 μl/min，后等待5 min預(yù)防對比劑反流。將大鼠以俯臥位放入MR掃描儀行注射后掃描。

本研究發(fā)現(xiàn)外界刺激可調(diào)控大鼠相關(guān)腦區(qū)ECS內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。物質(zhì)在ECS內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程復(fù)雜、影響因素較多，既與ECS的生物物理性質(zhì)(如空間紆曲度、液體黏度等)有關(guān)，也與物質(zhì)的化學(xué)物理性質(zhì)(如分子量大小、電荷等)有關(guān)。最近研究[7,10]證實擴散和體流是物質(zhì)轉(zhuǎn)運的兩種運動形式，腦淺表的皮層神經(jīng)元活動可引起一過性的物質(zhì)擴散速度減慢[11]。本研究采用體外痛覺刺激后發(fā)現(xiàn)痛覺相關(guān)腦區(qū)——丘腦ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和清除顯著變慢，進一步證實體外刺激可調(diào)控相關(guān)腦區(qū)ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運活動的規(guī)律，且實現(xiàn)了深部核團的檢測，也實現(xiàn)了對這種轉(zhuǎn)運變化的實時監(jiān)測成像。

因此，本文通過總結(jié)目前醫(yī)養(yǎng)結(jié)合養(yǎng)老服務(wù)評價研究的現(xiàn)狀，依據(jù)系統(tǒng)理論和相關(guān)利益者理論，結(jié)合采用DEA評價方法，對醫(yī)養(yǎng)結(jié)合服務(wù)進行績效評價模型的設(shè)計，并以青島市養(yǎng)老服務(wù)機構(gòu)為例進行實證分析，提出改進醫(yī)養(yǎng)結(jié)合養(yǎng)老服務(wù)的路徑，以彌補現(xiàn)有研究的不足，促進醫(yī)養(yǎng)結(jié)合養(yǎng)老服務(wù)的新發(fā)展。

但本研究未發(fā)現(xiàn)大鼠尾狀核-運動組和尾狀核-對照組Gd-DTPA的t1/2存在差異，可能原因為：尾狀核是運動環(huán)路的重要部位，主要參與獎賞-控制性運動和獎賞-自主性運動，通過尾狀核建立的這種獎賞引導(dǎo)型運動體系，生物體可趨利避害[12]。但相對于在痛覺感受中處于核心地位的丘腦[13]，尾狀核在運動的發(fā)生和感受中居于輔助地位，尾狀核的損傷甚至切除并不會導(dǎo)致明顯的運動障礙[14]；另外解剖學(xué)上顯示尾狀核主要由神經(jīng)纖維構(gòu)成，其細胞密度遠低于丘腦區(qū)。上述原因均可導(dǎo)致外界刺激后尾狀核區(qū)ECS的變化程度遠小于丘腦，對其內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的影響并不顯著。

本研究的局限性：未對ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運受外界刺激調(diào)控的機制進行進一步研究，影響ECS內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的相關(guān)因素較多，如神經(jīng)細胞生理活動、細胞外基質(zhì)、組織間液的成分和流動、水通道蛋白等。今后需探尋與調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵性因素。

綜上所述，本研究通過磁共振示蹤法證明大鼠深部腦ECS內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運可被外界刺激調(diào)控，有助于理解大鼠腦功能活動和其運作機制，也可為優(yōu)化經(jīng)腦ECS途徑給藥技術(shù)提供支撐。

[1] Deco G, Rolls ET, Albantakis L, et al. Brain mechanisms for perceptual and reward-related decision-making. Prog Neurobiol, 2013,103:194-213.

[2] He C, Chen F, Li B, et al. Neurophysiology of HCN channels: From cellular functions to multiple regulations. Prog Neurobiol, 2014,112:1-23.

[3] Frischknecht R, Gundelfinger ED. The brain's extracellular matrix and its role in synaptic plasticity. Adv Exp Med Biol, 2012,970:153-171.

[4] EL Andaloussi S, M?ger I, Breakefield XO, et al. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov, 2013,12(5):347-357.

[5] Xu F, Hongbin Han, Yan J, et al. Greatly improved neuroprotective efficiency of citicoline by stereotactic delivery in treatment of ischemic injury. Drug Deliv, 2011,18(7):461-467.

[6] Han H, Shi C, Fu Y, et al. A novel MRI tracer-based method for measuring water diffusion in the extracellular space of the rat brain. IEEE J Biomed Health Inform, 2014,18(3):978-983.

[7] Syková E, Nicholson C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev, 2008,88(4):1277-1340.

[8] Lei Y, Han H, Yuan F, et al. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Prog Neurobiol, 2017,157:230-246.

[9] Wolak DJ, Thorne RG. Diffusion of macromolecules in the brain: Implications for drug delivery. Mol Pharm, 2013,10(5):1492-1504.

[10] Iliff JJ, Wang M, Zeppenfeld DM, et al. Cerebral arterial pulsation drives paravascular CSF-interstitial fluid exchange in the murine brain. J Neurosci, 2013,33(46):18190-18199.

[11] Xie L, Kang H, Xu Q, et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science, 2013,342(6156):373-377.

[12] Kravitz AV, Kreitzer AC. Striatal mechanisms underlying movement, reinforcement, and punishment. Physiology (Bethesda), 2012,27(3):167-177.

[13] 熊文娟,何來昌,譚永明,等.經(jīng)典三叉神經(jīng)痛患者腦局部自發(fā)活動的靜息態(tài)功能MRI.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2017,33(9):1321-1325.

[14] Villablanca JR. Why do we have a caudate nucleus? Acta Neurobiol Exp, 2010,70(1):95-105.