丹酚酸B通過調節Nox4信號通路改善高脂飲食小鼠骨代謝的實驗研究

王麗麗, 馬如風, 劉海霞, 朱如愿, 柳辰玥, 李 琳, 陳貝貝, 賈強強，高思華, 張東偉

(北京中醫藥大學 1. 中藥學院、2. 中醫學院、3. 糖尿病研究中心，北京 100029)

骨質疏松癥是一種以骨量降低、骨微結構破壞、骨脆性增加、骨強度下降和骨折風險性增加為特征的全身性、代謝性骨骼系統疾病，其最大的風險是骨折，尤其是髖部骨折，其中，近1/3的患者因此殘疾和死亡[1]。流行病學調查顯示，飲食中脂肪和肉類豐富的西方女性骨質疏松和骨折的發病率明顯高于飲食中豆類食品豐富的東方女性[2]。研究也表明，高脂飲食與骨質疏松的發病密切相關。高脂飲食可導致脂質代謝調節紊亂，骨骼微環境改變和炎癥增加，促進破骨細胞形成，最終導致骨礦物質密度(bone mineral density, BMD)下降，骨強度下降和骨微觀結構惡化[3]。研究發現，♀ SD大鼠用高脂飼料喂養3個月后體內破骨細胞數量超過成骨細胞數量[4]。這說明高脂飲食促進大鼠破骨細胞形成，抑制成骨細胞形成，使大鼠股骨的骨量丟失。同時，高脂飲食使機體抗氧化因子含量降低，炎癥遞質釋放增加，促使小鼠骨質疏松的發生[5]。同時，高脂飲食引起C57BL/6J小鼠下頜骨的骨量丟失[6]。

丹參是一種用于預防和治療心血管疾病的傳統中藥。近年來，越來越多的研究表明，以丹酚酸B為代表的水溶性成分具有調節骨代謝的作用，其作用機制可能與Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)、細胞外信號調節的蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、骨保護素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)以及叉頭轉錄因子(Forkhead box O, FoxO)介導的氧化應激等多種信號通路相關[7-8]。我們前期研究也發現，高脂飲食引起小鼠牙槽骨的骨量丟失。而丹酚酸B可以通過改善高脂飲食引起的氧化應激，從而抑制牙槽骨骨量丟失。其可能的機制是丹酚酸B通過調節NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4, Nox4)/核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)/組織蛋白酶K(cathepsin K)通路，改善牙槽骨骨量丟失[9]。但是，丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨代謝和骨微結構的影響目前尚不清楚。因此，為了探索丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨代謝作用和可能的作用機制，本研究擬觀察丹酚酸B干預治療高脂飲食的C57BL/6J小鼠12周后，小鼠股骨微結構和生物力學變化，以及其可能對氧化還原通路Nox4-NF-κB-cathepsin K的調節作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 博勒飛質構儀CT3，美國BROOKFIELD公司；RM2255徠卡輪轉式切片機，德國Leica公司；BX53 倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.1.2試劑 骨組織抗原修復液，購自上海舜百生物科技有限公司；番紅O-固綠購自美國Sigma-Aldrich公司；cathepsin K抗體(ab19027)和NF-κB-p65抗體(ab16502)，購自美國Abcam Biocompany公司；Nox4多克隆抗體(NB110-58849)，購自美國Novus Biologicals公司；DAB顯色液，購自中杉金橋生物科技公司；高脂飼料(MD12032)，包括45%脂肪、20%蛋白質和35%碳水化合物，購于江蘇美迪森生物醫藥有限公司。

1.1.3實驗動物 SPF級C57BL/6J ♂小鼠，體質量18～20 g，購自北京華阜康動物科技有限公司。飼養于北京中醫藥大學科研實驗中心清潔級動物實驗室，合格證號：SCXK京(2011-0024)，室溫(20±2)℃，相對濕度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。實驗期間，各組小鼠給予自由飲水。

1.2方法

1.2.1動物模型的構建 同王麗麗等[9]提供的方法，簡述如下：將30只C57BL/6J小鼠適應性喂養1周后，隨機等分為正常組、高脂組(HFD)和高脂+丹酚酸B(HFD+Sal B)組。高脂+丹酚酸B組每天給予丹酚酸B 125 mg·kg-1·d-1，正常組和高脂組小鼠每天給予等體積的蒸餾水，連續灌胃12周。實驗期間，正常組小鼠給予正常飼料飼養，其余兩組小鼠均給予高脂飼料飼養。

1.2.2取材及樣品制備 連續灌胃12周后，將小鼠用1%戊巴比妥(4 mL·kg-1)腹腔麻醉后，分離股骨。在冰上剝離股骨附著的肌肉組織，將其先置于10%中性福爾馬林中固定72 h，再放入15% EDTA鈉(pH 7.4)溶液脫鈣，脫鈣液每2周更換1次，連續脫鈣3個月后沖水，包埋，切片備用。

1.2.3股骨生物力學的測定 利用質構儀對各組小鼠股骨進行三點彎曲實驗測定骨生物力學性能。實驗前，顯微鏡下觀察所有標本，以確保所有測試標本完好無損，并用游標卡尺測量股骨股干的直徑。將小鼠股骨置于跨距為7 mm的兩個支撐點上，標本的寬面朝上水平放置，按程序使探頭緩慢下降，探頭的加速度為10 mm·(min2)-1，標本斷裂后繼續運行2 mm停止。根據探頭下降的距離與載荷數據，結合千分尺測量出的骨標本的斷端直徑生成骨的載荷-變形曲線，計算出最大撓度(maximum load，硬度形變量)和彈性載荷(elastic load，峰值壓力)等骨生物力學參數。

1.2.4股骨HE 染色 采用組織HE染色方法，簡述如下：將股骨石蠟切片(5 μm)常規HE染色，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

1.2.5番紅O-固綠染色 將股骨石蠟切片脫水，蘇木精染色5 min，在1% HCl-乙醇中蘸兩下分色，然后依次用0.05%固綠染色5 min，0.1%番紅O染色5 min。中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

1.2.6免疫組織化學染色 將股骨石蠟切片常規脫蠟至水，用抗原修復和山羊血清封閉后，分別滴加一抗NF-κB(1 ∶50)、Nox4(1 ∶50)和cathepsin K(1 ∶50)，4℃孵育過夜后，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。每組選取股骨切片中7個互不重疊的視野，采用Image Pro Plus 6. 0分析軟件進行圖像分析，測定陽性細胞的平均吸光度，取7個視野平均值進行分析。

2 結果

2.1丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨生物力學的影響各組小鼠股骨生物力學檢測結果見Tab 1，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨的硬度形變量和峰值壓力均明顯降低(P<0.05)。給予丹酚酸B治療12周后，與高脂組小鼠相比，高脂+丹酚酸B組小鼠股骨硬度形變量和峰值壓力均明顯升高(P<0.05)。

Tab 1 Effect of Sal B on changes of femur bone biomechanics in mice on high fat diet (±s, n=7)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsHFD

2.2丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨的微結構的影響小鼠股骨組織切片HE染色結果見Fig 1。光鏡(×200)下觀察發現，正常組小鼠股骨骨小梁排列整齊，呈網狀，骨微結構完整。與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨骨小梁結構紊亂、變細、斷裂，脂滴增多。與高脂組小鼠相比，高脂+丹酚酸B組小鼠股骨的骨小梁排列相對整齊，骨微結構形態明顯改善，骨小梁增粗排列較規則。這說明丹酚酸B能夠通過改善高脂飲食引起的骨微結構提高股骨質量。

Fig 1 Effect of Sal B on microstructure alterations in femurs of mice on high fat diet (×200)A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B

2.3丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中糖氨基葡聚糖含量的影響糖氨基葡聚糖(glycosaminoglycan，GAG)是在軟骨中發現的天然的碳水化合物，與羥磷灰石結合后促進成骨細胞分化。如Fig 2番紅O-固綠染色結果所示，GAG被番紅O染成紅色。與正常組小鼠相比，高脂飲食小鼠股骨干骺端GAG的面積減少，丹酚酸B干預12周后，GAG的面積明顯增加，這提示丹酚酸B有促進成骨細胞分化的作用。

Fig 2 Effect of Sal B on content of glycosaminoglycan(GAG, red color) in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B; D: GAG area in femurs.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

2.4丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中Nox4表達的影響如Fig 3所示，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨小梁表面和骨髓腔中可見Nox4表達增高(P<0.05)。與高脂組小鼠相比，高脂+丹酚酸B組小鼠股骨中Nox4水平明顯降低(P<0.05)。說明丹酚酸B可抑制高脂飲食引起的小鼠股骨Nox4的高表達。

2.5丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中NF-κB-p65表達的影響如Fig 4所示，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨中骨小梁斷裂面以及骨髓腔中可見NF-κB-p65表達明顯增高(P<0.05)。與高脂組小鼠相比，丹酚酸B治療12周后，小鼠股骨組織中NF-κB-p65的表達明顯降低(P<0.05)。

2.6丹酚酸B對高脂飲食小鼠股骨中cathepsinK表達的影響cathepsin K主要由破骨細胞分泌，被認為是破骨細胞活化和骨吸收的重要指標[10]。如Fig 5免疫組化染色結果所示，與正常組小鼠相比，高脂組小鼠股骨中cathepsin K表達增高(P<0.05)。丹酚酸B干預12周后，高脂飲食小鼠股骨cathepsin K表達明顯下降(P<0.05)。

3 結論

骨質疏松的病理過程包括骨組織微結構的破壞和骨骼脆性的增加。我們之前的研究發現，高脂飲食可以促使小鼠牙槽骨骨質疏松，而丹酚酸B可以明顯改善高脂飲食引起的牙槽骨骨微結構破壞和骨密度下降[9]。本研究發現，丹酚酸B可以改善高飲食小鼠股骨的微結構。實驗中我們采用三點彎曲實驗，通過對硬度形變量和峰值壓力指標的檢測，證明丹酚酸B可以提高高脂飲食小鼠股骨的骨強度。

Fig 3 Effect of Sal B on Nox4 expression in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B; D: Nox4 expression in femurs.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

Fig 4 Effect of Sal B on NF-κB-p65 expression in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

A: Normal; B: HFD; C: HFD+Sal B; D: NF-κB-p65 expression in femurs.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

Fig 5 Effect of Sal B on cathepsin K expression in femurs of mice on high fat diet (±s, n=7)

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHFD group.

Nox4主要由破骨細胞分泌，在破骨細胞分化和成熟的過程中表達增多。 Nox4的激活能促進破骨細胞分化成熟，從而誘發骨吸收，促進骨質疏松的發生發展。Nox4基因敲除小鼠骨密度升高，破骨細胞數量減少，破骨細胞標志物水平下降。骨質疏松病人骨中的破骨細胞活性增加，Nox4表達增多[11]。研究發現，高脂飲食引起C57BL/6J小鼠Nox4的高表達，進一步導致NF-κB-p65高表達[12-13]。高脂飲食誘導小鼠牙槽骨中Nox4和NF-κB-p65的高表達[9]。本研究也發現，丹酚酸B抑制高脂飲食小鼠股骨中Nox4和NF-κB表達。

骨骼由大約60%的鈣羥磷灰石和40%骨基質蛋白構成。其中，主要的蛋白是Ⅰ型膠原蛋白。cathepsin K是由破骨細胞分泌的發揮降解骨基質蛋白最主要的酶，特別是對Ⅰ型膠原蛋白的降解[14]。NF-κB活化后可通過調節NFATc1等基因，促使cathepsin K的高表達，促使骨質疏松的發生[9]。我們前期的研究發現，高脂飲食能誘發小鼠牙槽骨組織的NF-κB的活化和cathepsin K的高表達，引起小鼠股骨微結構破壞[9]。本研究也證明，高脂飲食可以使小鼠股骨組織的NF-κB和cathepsin K表達量上升，引起小鼠股骨強度下降和骨微結構破壞。而給予丹酚酸B干預高脂飲食小鼠12周后，股骨中cathepsin K 表達下降，骨微結構改善，骨強度有一定程度的提高。

軟骨細胞分泌的細胞外基質主要分為三類：①膠原類：以II型膠原為主，是維持組織強度的來源；②結構糖蛋白：如纖維黏連蛋白；③蛋白多糖類：主要為GAG，包括硫酸軟骨素、硫酸角質素和肝素。其中GAG是軟骨的主要細胞外基質，是關節軟骨的主要成分之一，占透明軟骨干重的20% ～40%[15]。GAG具有促進成骨的作用。研究發現，硫酸軟骨素A具有促進兔下頜骨的新骨形成。本研究中我們發現，丹酚酸B可以提高高脂飲食小鼠股骨中GAG的含量。這表明丹酚酸B可以促進成骨細胞的分化，但其作用機制需要進一步的探索。

綜上所述，高脂飲食小鼠表現出明顯的股骨微結構破壞，骨強度下降。丹酚酸B可通過調節Nox4/NF-κB/cathepsin K信號通路而改善股骨代謝。本研究也首次證明丹酚酸B具有抑制小鼠股骨cathepsin K表達的功能。

(致謝：本實驗在北京中醫藥大學糖尿病研究中心進行，對實驗中給予指導和幫助的老師和同學表示感謝。)

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