環阿爾廷烷型四環三萜化合物對HCT116細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響

代曉麗，劉 靜，年 寅，邱明華，張繼虹

(1. 昆明理工大學醫學院衰老與分子遺傳學實驗室；2. 中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650500)

結直腸癌屬于一種常見消化道系統惡性腫瘤，其發病率和死亡率較高[1]，尤其是亞洲國家，包括中國[2]。目前，治療結腸癌的有效藥物非常少，急需探索開發[3]。升麻CimicifugafoetidaL.是毛茛科升麻屬多年生草本植物，它的根莖(主要入藥部分)已經收錄在《中國藥典》中。我國云南省的大理、香格里拉地區有豐富的云南升麻(C.yunnanensis)和綠升麻(C.foetida)[4]。目前，從升麻屬植物中提取分離的單體化合物主要有環阿爾廷烷型三萜皂苷(如升麻醇和升麻亭)和肉桂酸衍生物(如咖啡酸和阿魏酸)。具有抗過敏、緩解婦女更年期綜合癥、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[5]。研究發現，興安升麻中三萜皂苷對急性粒細胞白血病細胞和肝癌細胞有很強的細胞毒作用，其機制可能與細胞周期抑制有關[6]。體外研究發現，具有細胞毒活性的三萜皂苷類化合物對12種人腫瘤細胞株具有一定殺傷效果，特別是肺癌A549細胞株效果明顯[7]。同時，在人腫瘤裸鼠模型上也表現出對腫瘤生長的抑制作用[8]。另有研究發現，類葉升麻苷通過抑制小鼠皮層組織caspase-3基因表達，進而維持皮層組織神經細胞的正常形態及數量，對小鼠腦損傷具有明顯保護作用[9]。從中藥材的地域特異性出發，對取材于云貴高原的升麻提取物進行抗腫瘤活性研究，將對未來研究抗腫瘤藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人類結腸癌上皮細胞株(HT-29、HCT116、SW480)、人類乳腺癌細胞株(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468)購自中國科學院上海細胞庫；正常野生型小鼠成纖維MEF細胞由本實驗室提供。

1.1.2 受試化合物與試劑 化合物KY17由中國科學研究院昆明植物研究所提取、分離。噻唑藍(MTT，貨號M2128)、DMSO(貨號D2650)、碘化丙啶(PI，貨號P4170)均購自美國Sigma公司； Annexin Ⅴ(BD公司，貨號556570)；RPMI 1640 培養基 (Gibco 公司，貨號30800-022)；RNA 提取試劑盒(天根生物科技，貨號DP419)；凋亡染色試劑盒(北京四正柏生物公司，貨號FXP021)；胎牛血清(Biological Industries，貨號04-001-1 B/A)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細胞增殖 細胞培養后，待細胞傳代3次以上，選擇生長穩定且處于對數期的細胞接種于96孔板中，在37℃ CO2培養箱內培養，使其貼壁生長。加藥處理后，放回培養箱中培養72 h后，先觀察藥物處理后細胞生長情況、密度、形態等。再加入20 μL MTT(0.5 g·L-1)，在培養箱中培養4 h。然后小心吸出培養基，并加入150 μL DMSO，在37℃避光恒溫箱里震蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長下測定每孔的吸光值(OD)。根據OD值計算IC50值。

1.2.2PI染色測定細胞周期 以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁之后，加藥處理。藥物處理時間到達后收集細胞，用1×PBS洗2次，1 000×g，離心5 min。用70%的乙醇4℃固定過夜。加入RNAnase 緩沖(Rnase A 1 μg·L-1，EDTA 20 mmol·L-1，1×PBS) 37℃溫育30 min后，加入PI 工作液(1 mg·L-1)，并輕輕混勻，常溫避光染色2 h。流式細胞儀檢測DNA含量變化，采用Flowjo7.6軟件進行分析統計。

1.2.3AnnexinⅤ/PI雙染色檢測細胞凋亡 以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁之后，加藥處理。藥物處理時間到達后，收集細胞。用400目的尼龍篩進行過濾，用血球計數板進行細胞計數，每個樣品收集1×105個細胞。將細胞沉淀按照試劑盒的說明書，用100 μL的緩沖液重懸，每個樣品加入5 μL的Annexin V-FITC，37℃避光染色20 min。每個樣品加入10 μL的PI染液，37℃避光染色10 min。流式細胞儀檢測，根據陰性對照組進行設門和調節電壓，采用BD Accuri C6進行分析統計。

1.2.4蛋白免疫印跡技術 經藥物處理后，收集細胞沉淀，再用細胞裂解液提取總蛋白。Bradford法進行蛋白定量。按照定量濃度，每孔上樣量為15 μg，金屬浴100℃恒溫10 min，冷卻后，上樣。經4%～20%的梯度膠進行約1.5～2 h、180 V恒壓SDS-PAGE電泳。待電泳結束后，將蛋白全部轉移到PVDF膜上。轉膜完畢，用PBST清洗2次，每次5 min。將膜放入PBST 配制的10%脫脂奶緩沖液中封閉1 h，再用PBST清洗3次，每次5 min。加入按1 ∶10稀釋好的一抗，放于4℃搖床搖晃過夜。再用PBST清洗3次，每次5 min。加入用PBST稀釋好的二抗，室溫搖床搖晃1～1.5 h，PBST清洗3次，每次10 min。清洗干凈的膜按順序擺放在暗盒上，正面朝上，加上顯影發光劑，檢測蛋白。

1.2.5實時熒光定量PCR 每孔1×105個細胞接種于培養皿中，待細胞完全貼壁后，加藥處理，試劑盒提取總RNA，用紫外分光光度儀測RNA濃度。參照First-Strand Synthesis System for q-PCR試劑盒說明書反轉錄成cDNA。將cDNA加ddH2O稀釋，使用5×SYBR Green PCR Master Mix的反應體系分裝到RT-PCR專用96孔板中，熒光定量PCR儀檢測。引物序列如下：miRNA-34a Forward：5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGG-3′，Reverse：5′-TATCCAGTG CGTGTCGTG-3′；U6 Forward：5′-CGCTTCACGAATTT GCGTGTCAT-3′，Reverse 5′-GCTTCGGCACATATACT AAAAT-3′；GAPDH Forward 5′-TGCACCACCAACTG CTTAG-3′，Reverse 5′-GGCATGGACTGTGGTCAT-3′。

2 結果

2.1KY17對腫瘤細胞增殖的影響為了檢測升麻中提取的化合物對腫瘤細胞增殖的影響，我們選用了兩株小鼠腫瘤細胞(p53-/-+v+Ras/p53-/-+s+Ras)和一株正常野生型小鼠成纖維(MEF)細胞。MTT檢測結果表明，KY17作用于MEF細胞的IC50為27.28 μmol·L-1，作用于小鼠腫瘤胞的IC50分別為13.10 μmol·L-1和13.94 μmol·L-1，約為小鼠正常細胞的2.08和1.96倍(Tab 1)，結果提示KY17具有一定的抗腫瘤活性。我們還檢測了KY17對人類結腸癌上皮細胞(HT-29、HCT116、SW480)、人類乳腺癌細胞(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468)增殖的影響。結果表明，KY17的對結腸癌上皮細胞株具有抑制增殖的作用，對乳腺癌細胞株的抑制作用較小，且IC50值都大于50 μmol·L-1。KY17對HCT116細胞的抑制作用較明顯，當KY17濃度到達1 μmol·L-1時，與對照組相比有明顯的抑制作用，IC50值為9.31 μmol·L-1(Tab 1,Fig 1)。

Tab 1 Tumor proliferation activity inhibited by KY17

2.2KY17對HCT116細胞周期的影響細胞周期調控紊亂導致的腫瘤細胞失控性增殖是惡性腫瘤最常見的生物學特征。因此，通過流式細胞儀檢測KY17對HCT116細胞的周期變化情況。如Fig 2所示，與對照組(26.60%)相比，用KY17處理HCT116細胞的DNA合成期和分裂期(G2/M)的細胞比例增加，分別為36.61%、38.05%、38.91%，有濃度依賴性。結果表明，化合物KY17抑制結腸癌細胞增殖通過G2/M 期周期阻滯來實現。

Fig 1 KY17 inhibition of HCT116 cell proliferation detected by MTT assay

A: Chemical structure of KY17; B: KY17 on HCT116 cell proliferation.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3KY17誘導HCT116細胞凋亡KY17處理HCT116細胞48 h，AnnexinⅤ/PI 雙染后，用熒光顯微鏡觀察細胞的熒光強度。早期凋亡細胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，并與AnnexinⅤ結合，出現綠色熒光。隨著濃度增加，帶有綠色熒光的細胞數量越來越多，表明早期凋亡的細胞比例增多(Fig 3A)。與對照組(2.04%)相比，KY17處理HCT116早期凋亡的細胞比例分別為14.26%、15.32%、30.46%。晚期凋亡的細胞核上易被PI染色，發出橙紅色熒光。與對照組(0.8%)相比，KY17處理HCT116晚期凋亡的細胞比例為9.14%、13.87%、28.00%(Fig 3B)。

為了確證KY17能誘導HCT116凋亡，采用流式細胞術分析KY17處理24、48 h的HCT116細胞的凋亡情況。Fig 4結果顯示，KY17處理24 h，早期凋亡比例趨于平穩；而與對照組(1.1%)相比，晚期凋亡的細胞比例增加至1.3%、6.2%、5.6%。KY17處理48 h，與對照組(3.6%)相比，早期凋亡的細胞比例增加至4.3%、5.0%、5.1%，晚期凋亡的細胞比例從對照組的2.3%增加至2.5%、3.5%、9.9%。結果表明，KY17呈濃度依賴和時間依賴性地誘導 HCT116 細胞凋亡。用Western blot檢測凋亡相關蛋白PARP的表達情況。Fig 5結果顯示，KY17處理后的細胞，PARP蛋白有切割。隨著KY17濃度的增加，PARP蛋白切割越明顯。相同濃度處理48 h的切割比24 h更加明顯。以上結果表明，化合物KY17可誘導HCT116細胞凋亡。

Fig 2 Effect of KY17 on cell cycle of HCT116 cells

A:KY17 histogram of HCT116 cells cycle; B: Quantitative map of KY17 on HCT116 cells.

2.4KY17對HCT116細胞miRNA表達影響p53是重要的抑癌基因，能夠調節許多miRNA的表達。為了研究KY17是否調控miRNA的表達，用10 μmol·L-1的KY17處理HCT116細胞72 h后，qPCR檢測發現KY17使HCT116 細胞的miRNA-34a上調1倍(Fig 6A)。同時，檢測發現p53蛋白表達增加(Fig 6B)。

Fig 3 Effect of KY17 on apoptosis of HCT116 cells by fluorescence microscopy

A: Fluorescence microscopy was used to detect the apoptosis of HCT116 cells in KY17; B: Fluorescence microscopy was used for quantitative analysis of apoptosis.**P<0.01vscontrol

Fig 4 Effect of KY17 on apoptosis of HCT116 cells by flow cytometry

A: Flow cytometry was used to detect effect of KY17 on HCT116 cell apoptosis; B: Cell apoptosis quantitative bar graph.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5 Effect of KY17 on HCT116 cell PARP protein expression by Western blot

Fig 6 Effect of KY17 on miRNA-34a and p53 protein in HCT116 cells

A:Expression of miRNA-34a in HCT116 cells was detected by qPCR; B: Expression of p53 protein in HCT116 cells was analyzed by Western blot.**P<0.01vscontrol

3 討論

近年來，包括本實驗室在內的多個研究團隊發現升麻中含有很多抗腫瘤的活性物質。本實驗室先前研究發現KY17對乳腺癌細胞抑制活性較弱，但能誘導結腸癌HT-29細胞發生凋亡和自噬[10]。另有研究表明，從云南升麻中得到的新骨架分子Cimyunnins A-D存在乳腺癌抑制活性，這些分子的抗血管生成活性與一線藥物舒尼替尼相當，它們代表了一種新穎的抗血管生成活性分子的結構模板[11]。與此同時，研究還發現，其中一個分子KHF16能夠有效抑制三陰性乳腺癌(TNBC)細胞系(MDA-MB-468細胞、SW527細胞)的體外存活，降低XIAP、Mcl-1、Survivin和 Cyclin B1/D1等蛋白的表達水平，并能抑制TNBC細胞中NF-κB信號通路[12]。這些研究結果表明，來源于升麻的活性分子具有抑制多種腫瘤細胞增殖的活性，并且拓寬了研究者對升麻抗腫瘤活性的認識，為中藥升麻的研究提供了思路。

本研究發現，升麻中環阿爾廷烷型四環三萜化合物KY17對HCT116細胞具有抑制增殖的作用，并且呈現藥物濃度依賴性。這種抑制增殖的作用通過誘導HCT116細胞G2/M期阻滯和細胞凋亡來實現。我們還發現KY17激活PARP蛋白表達，進而誘導HCT116細胞凋亡。但是，細胞周期調控和細胞凋亡涉及多因子和多層次作用，還需要進一步研究探索。

p53是最重要的抑癌基因，研究發現p53能夠調節許多miRNA的表達[13]。其中，miRNA-34a是一類在進化上高度保守的miRNA，其主要功能包括細胞周期的阻滯和誘導細胞凋亡[14]。同時，DNA的損傷也能誘導miRNA-34a的表達上調，而miRNA-34a的上調依賴于p53基因的激活[15]。本研究初步探索發現，KY17作用于HCT116細胞會誘導p53激活，同時誘導miRNA-34a上調。因此，KY17誘導HCT116細胞周期阻滯和凋亡是通過激活PARP和p53表達，上調miRNA-34a來實現的。新分子化合物通過調控腫瘤細胞的信號通路，誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯來抑制增殖的研究是當今的熱點，這也為本研究提供了方向。

(致謝：本實驗在昆明理工大學醫學院衰老與分子遺傳學實驗室完成，在此致以由衷的感謝！)

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