棘球蚴(包蟲)病預防疫苗的研制與應用

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我國有兩種類型的棘球蚴病(包蟲病)，即囊型棘球蚴病(CE)和泡型棘球蚴病(AE)。囊型棘球蚴病由細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，Eg)引起，泡型棘球蚴病由多房棘球絳蟲(E.multilocularis，Em)引起。棘球蚴病控制的長期性和復雜性決定了其控制措施應是簡便，經濟和有效的。通過免疫預防手段切斷病原循環鏈是控制研究的方向，其應用將大大縮短控制進程[1-2]。20世紀80年代以前，人們對寄生蟲病的免疫預防研究多持謹慎態度，防治重點是在藥物防治方面，有效的藥物治療在寄生蟲病的防治中起到了十分重要的作用。但近年來，由于經典的抗寄生蟲藥(如氯喹、氯苯胍等)對一些寄生蟲病的治療作用不斷減弱，有些地區(如在非洲)幾乎失去使用價值。耐藥風險的增加使人們又重新將目光轉移到免疫學預防方面。然而，蠕蟲由于其長期的適應和進化，產生了一系列的逃避機制，加大了疫苗研制的難度。但隨著免疫學、細胞生物學、分子生物學等新技術的應用，抗寄生蟲蟲苗的研究也取得了長足進展。

1 抗細粒棘球絳蟲疫苗研制的策略

如果通過免疫接種的方式切斷棘球蚴病原循環鏈，無論是消除中間宿主的中絳期，還是終末宿主的成蟲，或是阻斷蟲卵的產生，都可以控制棘球蚴病的傳播。長期的控制實踐表明，只有控制技術的突破，才能迅速控制包蟲病。免疫接種犬和綿羊等宿主，將省去高頻度對犬驅蟲的高投入和困難，加快控制進程。另外，從宿主的數量上講，犬的數量要比家畜的數量少幾倍或幾十倍，免疫接種犬，是一種理想化的棘球蚴病控制手段[3]。

在疫苗研制的策略方面，由于中絳期幼蟲和成蟲在宿主體內寄生部位的不同，對抗原的篩選和誘導產生的保護性反應也不同。細粒棘球絳蟲的中絳期即包囊寄生在中間宿主的實質性器官中，抗原誘導的反應應以誘導系統免疫為主；而成蟲寄生在終末宿主的小腸內，所誘導的免疫反應應以誘導局部的腸道粘膜免疫反應為主。

同許多傳染病的感染途徑一樣，棘球蚴病也是“病從口入”。中間宿主食入絳蟲蟲卵后，在胃液胃蛋白酶和小腸胰蛋白酶的作用下脫去卵殼，并激活六鉤蚴，六鉤蚴分泌蛋白酶(穿刺酶)[4]并借助自身的收縮變形運動，使其“破腸壁，進血流”，這個過程是設計中間宿主抗蟲疫苗的重要考慮因素。誘導特異的腸道粘膜免疫反應，阻止六鉤蚴“破腸壁，進血流”，和定居應是疫苗研制的思路。

孵化后的六鉤蚴可以在很短的時間內定居于靶器官，主要是肝臟和肺臟，通過免疫接種誘導的免疫反應殺滅和抑制幼蟲是疫苗設計的思路。一般認為多細胞蠕蟲病原體長期的進化和演變使其與宿主產生了共生的關系，很難通過免疫接種的途徑消除病原體。但研究表明，通過疫苗接種，抑制寄生蟲的生長發育，固著，生殖，運動和其對營養物質的吸收是疫苗研制的突破口。中絳期疫苗研制的靶基因應當是六鉤蚴定居，包囊生長和營養代謝有關的基因；成蟲期的靶基因應當是與營養物質的吸收，神經，生殖，固著和運動有關的基因[5]。對保護抗原篩選，目前主要采取以下幾種途經：用感染血清篩選病原體抗原；根據已知保護性抗原，克隆同源蛋白抗原；根據蛋白在病原體發育的重要性定向并有目的地篩選病原體抗原。

2 中間宿主接種疫苗的研制

對帶科絳蟲中間宿主抗感染的免疫生物學研究推動了疫苗學的研究和發展。最早采用的方法是對抗再感染能力的評估，主要是依據伴隨免疫的特點。中間宿主初次感染帶科絳蟲幼蟲后，可以激發伴隨免疫，并可以抵抗再次感染。通過感染中間宿主，分離血清，用血清篩選六鉤蚴抗原或表達基因庫，已成功找到幾種抗帶科絳蟲，例如大鼠寄生的巨頸絳蟲(Taeniataeniaeformis)，兔體內寄生的豆狀帶絳蟲(T.pisiformis)，牛體內的牛帶絳蟲(T.saginata)和羊體內的泡狀帶絳蟲(T.hydatigena)幼蟲的保護性抗原[6-8]。羊是細粒棘球絳蟲最適合的中間宿主。研究表明，一旦羊感染細粒棘球蚴可以產生很高的抗二次感染的能力。

用帶科絳蟲提取物作為抗原接種中間宿主可以產生非常高的免疫保護。Gemmell首次證明，用激活的六鉤蚴或細粒棘球絳蟲蟲卵的提取物免疫羊，然后對口服蟲卵的攻擊，可獲得高的免疫效果，減少90%的包囊生長率。兩次或多次接種六鉤蚴抗原，綿羊可產生完全的保護。用六鉤蚴體外培養物免疫羔羊兩次，可以獲得類似的保護水平[9]。

這些研究清楚地表明，六鉤蚴或其分泌物，是保護性抗原的重要來源，這些抗原可引起體內完全的或近完全的的保護效果。為尋找六鉤蚴有效的保護性抗原，Heath和Lawrence用不同方法分離細粒棘球絳蟲六鉤蚴抗原，然后免疫羊，獲得了抗血清。再將這些血清用于免疫印跡，并通過六鉤蚴體外殺傷檢測，確定了細粒棘球絳蟲六鉤蚴不同組份蛋白的免疫力。用六鉤蚴提取物免疫綿羊后，進行攻擊感染實驗，獲得的抗血清，能夠殺死體外培養的六鉤蚴。在免疫印跡試驗中，血清能與23-25 kDa的六鉤蚴抗原成分發生明顯的抗原抗體反應，也能使機體產生抗六鉤蚴的免疫保護效果[10]。

用抗23-25 kDa抗原的抗血清篩選六鉤蚴cDNA文庫，獲得了一個克隆，EG95。通過亞克隆構建到表達載體上重組EG95-GST融合蛋白，接種綿羊取得了很高的保護率[11]。EG95疫苗已經在新西蘭，澳大利亞，阿根廷，中國和智利地區進行了試驗，其保護率在96%～100%[12-13]。用EG95免疫袋鼠，無論是在一個月或者九個月后，進行攻擊感染實驗，EG95都顯示出很高的保護效果，與綿羊體內獲得的保護效果(96%～100%)相類似[14]。目前EG95已經在我國大面積推廣使用，用于棘球蚴病的控制。

目前，隨著各種生物學新技術，尤其是分子生物學技術在寄生蟲學研究領域的應用，寄生蟲免疫學研究也不斷取得進展，在澳大利亞利用基因工程技術可以規模化生產牛巴貝斯蟲基因工程苗，人用惡性瘧原蟲基因工程苗已在坦桑尼亞等非洲國家試用了多年，并取得了令人振奮的臨床保護效果。抗絳蚴病重組蛋白疫苗，其中包括用于羊接種的抗羊帶絳蟲(Taeniaovis)病、用于牛接種的抗牛囊蟲(牛帶絳蟲，T.sagatina)病、用于豬接種的抗豬囊蟲(豬帶絳蟲，T.solium)病的疫苗取得重大進展[15]。這些疫苗都是從絳蟲的六鉤蚴(蟲卵)分離的蛋白，經基因的克隆，表達載體的亞克隆，在大腸桿菌或酵母菌中表達；再經蛋白的純化，與適當的佐劑配伍后，制備出重組疫苗。帶科絳蟲的六鉤蚴抗原可以誘導中間宿主產生保護性免疫可能是一個共性，已經成為疫苗研制中抗原篩選的方向。

根據EG95的基因序列，從E.multilocularis分離同源基因(EM95)與EG95有80%的等同序列。EM95與GST融合蛋白在大腸桿菌中表達和純化后，接種小鼠，然后口服多房棘球絳蟲蟲卵，結果表明使小鼠產生了83%的抗感染保護率[16]。

3 終末宿主疫苗的研制

細粒棘球絳蟲的成蟲寄生在犬科動物的小腸內，成熟后向體外隨糞便排出大量的蟲卵，使人和其它中間宿主感染致病。因此，蟲卵是原發性棘球蚴病感染的真正病原體。犬是細粒棘球絳蟲最主要的終末宿主，在流行病學中具有重要意義，對棘球蚴病的傳播流行起著關鍵的作用。控制研究表明，通過在成蟲成熟期前驅蟲，阻斷成蟲向環境中排放蟲卵，以切斷病源的傳播，可以控制該病的流行[17]。如果用免疫接種的方法達到減少細粒棘球絳蟲在犬體內的荷蟲數或阻止蟲卵的產生將極大簡化控制措施，加快棘球蚴病的控制進程。在我國采取 “犬犬投藥，月月驅蟲”的無蟲卵污染驅蟲措施，可以阻斷病原的傳播[17]。但高頻度的驅蟲在牧區的執行有很大的困難，若能對犬實施免疫接種預防，可以極大程度減少防控的工作量，加快包蟲病的控制。

在上世紀60到80年代，由新西蘭，澳大利亞和前蘇聯的科學家在犬抗細粒棘球絳蟲方面，尤其是在抗原的篩選方面進行了研究。Gemmell給犬接種成蟲和原頭蚴抗原，證明可使犬產生部分保護[3]。犬經過反復感染(最多八次)原頭蚴可以提高抗感染能力，并且發現原頭蚴生長被阻止，發育遲緩。給犬口服感染被輻射過的原頭蚴，其生長發育也受到阻礙。最近在不同高發流行國家和地區的流行病學調查表明，老齡犬的荷蟲數遠比幼犬體內的荷蟲數低。說明犬產生了獲得性免疫保護，而使其荷蟲數降低[18]。

從寄生生物學上講，細粒棘球絳蟲在犬小腸中的寄生有其獨有的特點。該絳蟲的頭節深埋于腸粘膜系統的Lieberk?hn小體，常常導致腸表皮細胞的損傷，說明發育中的細粒棘球絳蟲與犬腸粘膜上皮組織有著緊密的結合，為此，該成蟲也被稱之為“組織蠕蟲”。由于這種緊密的結合，使得蟲體抗原可以進入犬體腸道細胞內并被系統免疫和局部免疫系統所識別，激發一系列的抗蟲免疫[3]。

另外，哺乳動物的腸腔內可以發生一系列的免疫反應，比如上皮M細胞產生分泌型的免疫球蛋白IgA (sIgA)，粘膜肥大細胞(MMC)分泌白三烯和幼蟲移行抑制復合物，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性等，這些反應在抗蟲免疫中都起到重要的作用。

4 重組蛋白疫苗

重組技術是疫苗生產上的一個重大技術突破，但到目前為止，僅有少數幾個蛋白分子用于疫苗評估。Zhang等用差異顯示PCR(Differential display PCR)技術獲得了3個基因 (EgM4，EgM9 和EgM123)，屬于一種新的EgM蛋白家族。EgM家族基因僅在Eg成熟成蟲(MAWs)階段表達，可能參與成蟲的成熟和卵的發育[19]。用大腸桿菌表達EgM9和EgM123并接種犬，感染45 d后進行剖檢，可誘導犬產生95%的減蟲免疫保護[20]。Chabalgoity 等將Eg的脂肪酸結合蛋白(FABP)連接到鼠傷寒沙門(氏)菌減活菌株LVR01的aroC上，通過口服接種犬，結果顯示這一疫苗有很強的耐受性，并檢測到了特異性抗體及細胞應答[21]。將表達的Em基因片段(II/3-10)編碼種屬特異性抗原的鼠傷寒沙門(氏)菌LT2 M1C中免疫犬，在免疫早期也可得到相似的結果；通過皮下接種的方式將這個重組疫苗接種犬也會誘發強的體液免疫和淋巴細胞增殖[22]。用成蟲的兩種重組蛋白—原肌球蛋白 (EgTrp) 和纖維狀蛋白 (EgA31)制成犬用口服疫苗，通過口服免疫使犬對抵抗Eg成蟲產生保護，犬的荷蟲數減少了70%～80%，并且蟲體發育受阻[23]。

5 研制犬疫苗的挑戰和機遇

保護性抗原的篩選是研制犬抗蟲疫苗的當務之急。細粒棘球絳蟲是一個多細胞寄生蟲，只有采取多抗原多位點的攻擊，才能取得保護，而疫苗的效應應該是減少原頭蚴的轉化和在腸粘膜的固著以及阻止蟲體的發育。

終末宿主是吞食了包蟲囊內的原頭蚴，在其胃腸道組織液的作用下，原頭蚴經過外翻，變形蠕動，并且可能通過體表的蛋白肽感受體，找到小腸適當的位置定居，而寄生的部位是腸內蛋白肽最多的部位。絳蟲通過吸盤的吸附作用和頭鉤的錨定作用，固定在腸粘膜的利比昆小體的凹槽內。疫苗研制的策略可以通過抗體封閉蟲體表面的蛋白肽受體和蛋白肽趨化感受器，使蟲體不能在蛋白肽富集的小腸部位寄生，這樣蟲體便不會很好地發育或直接被排除體外以減少蟲體的數量。犬對細粒棘球絳蟲感染不僅可以產生很強的腸道粘膜免疫反應，而且可以引起體液免疫[24-26]。試驗表明犬血清中含有蟲體抗原的抗體時，不易感染[24]。補體的殺傷和裂解也可能是重要的保護機制之一[27-28]，但長期以來，免疫因子與抗蟲保護的關系沒有定論。研究表明[23-24,29]，血清IgG，腸道粘膜IgA，Th2 和Th1 淋巴因子與荷蟲量沒有相關性[26]。但由于試驗所用的犬數太少，而無法確定這些免疫因子與保護的關系。

犬免疫研制停滯的另一個原因是保護性抗原篩選的缺乏。隨著分子生物學的不斷發展，尤其是最近發表的Eg，Em和其它幾個蠕蟲的基因組和蟲體不同發育階段的轉錄組，不僅使我們對Eg的生物學有了更深的了解，同時使我們掌握了一批研制抗成蟲感染的候選基因[5,30]。另外，由于人們對腸道粘膜免疫的深入了解，使得研制抗腸道寄生蟲疫苗成為可能。

通過感染和化藥驅蟲[31]建立了抗感染模型[32]，證明Eg感染可以使犬產生強的Th2極性反應。兩輪感染和驅蟲治療后，犬產生了抗蟲免疫，蟲體的數量明顯減少，Th2免疫反應向Th1發展，說明Th1反應與抗性有關。IL-10，TGF-beta與荷蟲量沒有關系[32]。

目前還沒有一種用于接種犬科動物的疫苗預防棘球絳蟲的感染。由于包蟲病防控的長期性，對犬免疫接種的研究是必須的。從接種量和經濟的角度考慮，犬接種將遠遠低于對中間宿主的接種。使用適當的佐劑來改進疫苗也是今后研究的方向。細菌表達產物、來自于植物中的天然化合物以及微粒給藥系統是目前被廣泛研究的疫苗載體，并且有可能作為粘膜佐劑。Carol等用Eg原頭蚴的皮層抗原和ISCOMS以滴鼻的方式免疫犬，在唾液中檢測到了引起的粘膜IgA應答，在外周血中特異分泌IgA的細胞也增加了10-20倍[29]。雖然沒有更深入的報道，這種方法作為犬科動物宿主Eg和Em疫苗的遞藥系統可以作為進一步的研究方向。將細粒棘球絳蟲疫苗做成食餌喂犬是一種非常適當的方法，如果能與減活的鼠傷寒沙門(氏)菌一起進行口服免疫將是一種切實可行的途徑。在疫區應用同樣的方法，組合的狂犬病/包蟲病口服疫苗將會使包蟲病疫苗更便于應用。自然感染的犬已被免疫，是否免疫接種可以加強免疫使犬產生更有效的保護還不清楚，有待于進一步驗證。同樣，感染其它絳蟲例如泡狀帶絳蟲是否會影響疫苗的功效，重復的使用驅蟲劑是否會加強接種疫苗的效果也同樣沒有任何數據。如果研制疫苗的方向是抑制蟲卵的產生，那么疫苗接種后探明蟲體在腸道的存活和蟲卵的發生是至關重要的。

研制有效犬科動物Em疫苗目前還沒有進展，并且還不清楚原型Eg犬疫苗是否會提供一種交叉保護作用。控制Em野生動物傳播循環，在多數地區都是非常困難的，尤其是狐貍分布廣泛。然而在一些AE疫區，家犬在AE的傳播染中扮演著很重要的角色。接種犬預防泡球蚴病感染人群是今后泡球蚴防控研究方向。

6 結 語

犬是Eg最主要的終末宿主，在包蟲病的傳播中起到關鍵作用，調查證明我國人、畜包蟲病基本來源于犬。在我國西北農牧區，犬是家畜數量的四十分之一，所以對犬實行免疫預防具有實用性。包蟲病控制是一項長期的工作，其長期性表現為兩個方面：一是實際控制需要20～30年，二是控制后需要一個鞏固期，一般在島嶼國家或地區需要10～20年，內陸國家或地區將需要更長時間，疫苗的研制是包蟲病控制的發展方向。