聚合酶鏈反應檢測真菌感染的檢驗學研究

柳大芳 李 青 劉曉華

（1 遼寧省遼陽市中心醫院檢驗科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市疾病預防控制中心微生物檢驗科，遼寧 遼陽 111000）

近年來，臨床真菌感染的發病率和嚴重性明顯增加，從病灶中分離的真菌種類也愈來愈多。常規形態學和培養方法已不能滿足臨床需要，本研究應用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，以NSS-NS6為引物，擴增真菌同源性序列ssu-rDNA片段，通過檢測臨床主要致病真菌，探討PCR檢測真菌的具體實驗條件，試圖建立一種快速檢測真菌的PCR檢測方法。雖然用PCR方法檢測真菌單一菌種的研究不少，但檢測廣范圍真菌國內尚未見報道[1]。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑PCR擴增所用引物：5'AACTTAAAGGAATTGACGGAAG和5'GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC（賽百盛北京生物工程公司）。其他試劑均購自多元合眾科技發展有限公司。

1.1.2 標本。真菌：白色假絲酵母菌ID00147，新型隱球菌ID00044，熱帶假絲酵母菌ID00162，煙曲霉ID00203，購自中國醫學科學院南京皮膚病研究所真菌收藏中心；熱帶假絲酵母菌AS402，高大毛霉菌AS2232，黑根霉菌AS2257，購自中國科學院微生物研究所。所有菌種均保存于沙保氏瓊脂斜面培養基上。人體細胞：正常人新鮮全血2份，來自張家口市中心血站健康獻血員，用于人體細胞DNA擴增。細菌：大腸埃希氏菌CMCC44105，金黃色葡萄球菌ATCC8095，銅綠假單胞菌ATCC27313，甲型溶血性鏈球菌CMCC32213，乙型溶血性鏈球菌CMCC32204，肺炎鏈球菌CMCC31401，購自衛生部生物制品檢定所；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE)，協和醫院微生物科贈送。

1.2 方法

1.2.1 真菌DNA的提取：①將真菌于50 mL沙保氏液體培養基中25 ℃培養40 h，3000 r/nlin離心10 min，0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，沉淀-20 ℃冰凍4～6 h。②將冰凍菌與石英砂共同研磨至呈黏稠狀（邊研磨邊加入少量含50 mmol/L Tris-Cl pH7.2，50 mmol/L EDTA，3% SDS，1%2-琉基乙醇的溶液），3000 r/min離心10 min，去除石英砂，上清液65 ℃溫育1 h。③加入等體積酚：異戊醇：氯仿（25∶24 ∶1）溶液，10000 r/min離心15 min，至上清水相變清。④移出上層水相（注意勿帶人界面的細胞碎片），加入1/10體積3 mol/L乙酸鈉、2體積95%乙醇，混勻，4 ℃冰箱放置至少1 h，10000 r/min離心15 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀3次。⑤將離心管倒置，在無菌罩中干燥。⑥加入適量TE緩沖液（含10mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA）溶解沉淀，l μL溶液用于PCR擴增。

1.2.2 PCR擴增。①PCR擴增體系：總反應體積為100 μL，其中：10×擴增緩沖液10 μL；4×dNTP（每種濃度均為1 mmol/L）20 μL，終濃度為20 μmol/L；引物1和引物2（濃度20 μmol/L）各l00 pmo1；TaqDNA聚合酶0.5 μL（2.5 U）。②PCR擴增反應程序參照預變性：94 ℃，5 min。三溫循環：94 ℃變性1 min；58 ℃退火2 min；72 ℃延伸3 min。30個循環。末延伸：72 ℃10 min。約需3 h。③PCR擴增產物的分析：采用瓊脂糖凝膠電泳法對擴增產物進行分析。瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，內含0.5 μg/mL溴化乙錠（EB)，使用0.5×TBE電泳緩沖液。取10 μL擴增產物點樣，電壓為3.5 V/cm，電泳時間為40～60 min。PCR Marker作參照物，在紫外燈下觀察并拍照。

1.2.3 特異度及重復性實驗：對細菌、人體細胞擴增，以白色假絲酵母菌為陽性對照進行特異度實驗，方法用1.2.2并在不同日期重復3次。

1.2.4 靈敏度實驗：白色假絲酵母菌DNA用紫外分光光度計測其含量（10D約為50 μg/mL雙鏈DNA)，10倍稀釋為1ng～10 fg，按1.2.2的方法進行靈敏度實驗。

2 結 果

2.1 真菌DNA擴增結果：若樣本含有與引物相應的基因片段，擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見發淡黃綠色熒光的清晰條帶，即為陽性結果。本實驗中所有真菌均擴增出相同長度的DNA片段。對照PCR Marker，該基因片段約為310bp。表明該實驗所用引物系統是真菌所共有的，這與前人報道相符。

2.2 特異度及重復性實驗：以白色假絲酵母菌DNA為陽性對照進行擴增，8株細菌和2株人體細胞均未擴增出相應的產物。重復性實驗結果相同。

2.3 靈敏度實驗：以樣品中含有1ng～10 fg（10倍稀釋）純化的白色假絲醇母菌DNA進行靈敏度實驗，當含有1Pg DNA時，用該方法即可檢出。

3 討 論

患者發生感染時，臨床首要解決的問題是確定感染源的類型，雖然不同真菌感染其治療方案不盡相同，但兩性霉素B是常規治療藥物。由于兩性霉素B的毒性作用，臨床醫師在確診之前很少用此藥。但是，如能迅速確定真菌感染，盡早應用兩性霉素B會產生很好的療效。顯然，真菌感染的快速診斷具有重要臨床意義[2-3]。

PCR檢測真菌的特異度是由其應用的引物及其檢測的靶基因片段的特異度決定的。用于PCR真菌檢測的靶基因主要有以下幾類：①編碼細胞色素P450L 1A1的基因，其編碼唑類抗真菌藥物作用位點麥角固醇生物合成過程中的一種酶；或編碼真菌特異度保守蛋白如肌動蛋白的基因。其缺點是作為一個單倍體單拷貝基因，缺乏選擇性，且敏感度差。②白色假絲酵母菌特異度序列，如熱休克蛋白90基因等，只能擴增酵母菌而不能擴增其他真菌。③以多拷貝形式存在的rDNA序列，目前其檢測應用極受重視，原因有二：①其敏感度高于單拷貝靶基因的檢測。②有可供真菌不同水平檢測的靶基因序列。本研究就是用PCR方法，通過對真菌同源性序列ssu-rDAN片段擴增，以期建立真菌感染的檢測方法。目前，檢測真菌所用的引物很多，其中報道較多的是引物NS5-NS6。Hopfer和Polanco均以該引物擴增臨床主要致病真菌獲得成功。本研究以NS5-NS6為引物對臨床6種主要致病真菌以及8種細菌和2株人體細胞進行擴增，真菌全部擴增出一個約310bp的片段，而細胞和人體細胞均擴增陰性，也證明該引物的擴增產物是真菌界所特有的DNA片段，可用于廣范圍真菌的鑒定。以瓊脂糖凝膠電泳法分析擴增產物，當樣品含有1pgNDA時即可檢出，這亦與前人報道基本一致[4]。

當然，該研究只是一個初步研究，還存在不少問題，如檢測真菌菌株較少，真菌破壁方法的改進等，需今后進一步研討。

總之，以上研究結果表明用PCR擴增真菌同源性ssu-rDNA具有高度的特異度和敏感度，而且縮短了檢出時間。若深入研究，有可能成為診斷真菌感染的一種實用、理想的方法。