DDNNAA條形碼技術及其在動物物證鑒定中的應用

馬艷君 周用武 黃婭琳

野生動植物是地球自然資源的重要組成部分，具有很高的生態意義，并包括了科學、文化、經濟在內的多方面價值。然而，隨著人類文明的不斷發展和社會的進步，野生動物的棲息地已經并仍在被人類不斷侵蝕，加之動植物資源過度消耗，全球動植物資源總量下降較快。由于高額利益驅使，近年來，非法野生動植物及其制品貿易犯罪鏈條已相當完備，犯罪手法不斷變換，破壞野生動物資源的違法犯罪活動仍屢禁不止，野生動植物及其制品的非法貿易已成為繼毒品、武器之后的世界第三大非法貿易。為了規范管理涉及動植物的經濟活動，打擊違法犯罪行為，保護野生動植物資源，在規范管理和保護執法的過程中，必然要對涉及的動植物進行物種鑒定。

公安及相關部門偵辦動物案件時，常會遇到部分犯罪嫌疑人為逃避檢查和法律制裁，對動物尸體進行剝皮、肢解、掩埋、蒸煮或焚燒、深加工等，這使得涉案動物喪失了其宏觀形態學特征，常規形態學檢驗的方法不適用于這些上述檢材的鑒定。在這種情況下，就要利用微觀的分子生物學技術對相關檢材進行鑒定。采用DNA條形碼（DNA Barcoding）技術鑒定動物物種是近年來物種識別中最為熱門并發展最快的一項DNA分析技術，本文對DNA條形碼技術及其在打擊動物犯罪中的動物物證鑒定應用進行了概述。

一、DNA條形碼技術與形態學分類技術的比較

2003年，Hebert等將分子方法拓展至生物物種分類應用中，正式提出DNA條形碼的概念。DNA條形碼技術是一種建立在DNA序列標記技術及相關的系統發育和分類研究基礎上的物種鑒定方法，所用的DNA片段具有物種內特異性和物種間的多樣性，能夠快速、準確地對物種進行鑒定，類似于通過掃描商品條形碼識別具體商品種類的過程。由于DNA條形碼技術快速和容易操作，彌補了傳統分類學的缺陷，有利于發現新物種，具有巨大的科學應用潛力，在其他學科領域的研究中也得到了一定的應用。

物種鑒定是一項很艱巨的任務。Mora C等的研究預測動物種類數將達到777萬種，而已經描述和分類的生物有約953430種，更多的物種還有待人類去發現和分類；研究還表明，陸地上約有86%、海洋中約有91%的物種還沒有被人們發現和分類。然而目前關于物種鑒定最常用的形態學分類法卻存在著難以克服的缺陷：動物的表型可塑性（Phenotypic plasticity）和遺傳可變性（Genetic variability）容易導致鑒定的錯誤，且許多群體中普遍存在的隱存分類單元也無法用常規形態分類法進行鑒定；生物性別和發育階段也會影響傳統形態鑒定方法，導致很多生物無法被準確鑒定。此外，分類學家的識別能力也有局限性。形態學鑒定的局限性和不斷縮減的分類學家隊伍，使分類學的發展面臨巨大的挑戰。

21世紀初分子生物學的巨大進步以及海量生物分子遺傳信息的互聯網共享為上述問題提供了一個解決方法。DNA條形碼技術在從病毒、細菌、原生動物到脊椎動物等高等生物的識別中均有極佳表現，可以很好地識別生物的多樣性。在高等生物識別中，通過分析動物線粒體特定基因片斷序列就能鑒定該物種的技術，已經在物種多樣性調查中得到了廣泛應用，積累了大量的文獻和數據。這促進了以DNA序列作為生物物種鑒定平臺的發展。DNA條形碼技術可以快速識別物種的局部組織，鑒定不受物種發育階段以及個體形態特征的影響，不受物種的限制，并且有利于發現新種和隱存種。此外，該技術的準確度高，操作簡單易行，易于掌握和推廣。

二、用于動物種屬鑒定的DNA條形碼基因

作為DNA條形碼的序列應具備以下特征：一方面必須具有可區分物種的變異，同時要具有相對的保守性，種內變異要盡量小；二是其兩端要同相對保守的引物連接，以便設計通用引物；三是目標DNA片段應相對較短，以便于DNA的提取和擴增。

應用于動物界的DNA條形碼主要有線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）基因和核DNA（nuclear DNA，nDNA）基因。其中，mtDNA分子具備結構簡單、嚴格的母系遺傳、無重組、與核基因組無共同序列、進化速率快、多拷貝及分子鐘理論等優點，比nDNA更容易檢測，更容易受遺傳漂變的影響，并具有廣泛的種內和種間多態性，親緣關系相關或相近的物種都能得到區分和鑒定。mtDNA分子標記有很多，常被用作動物種屬鑒定的mtDNA基因有：線粒體細胞色素氧化酶1基因（Cytochrom-Oxidase I，CO I）、細胞色素b基因（cytochrome b，cyt b）、12S核糖體核糖核酸基因（ribosomal RNA，rRNA）、16S核糖體核糖核酸基因基因、線粒體DNA控制區（Displacement Loop Region，D-loop）、線粒體NADH脫氫酶基因（NADH Dehydrogenase，ND）等。此外，簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）或短串聯重復序列（short tandem repeats，STR）基因座、單核苷酸多態性標記（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）等核基因也被用于物種鑒定，并常用于動物個體識別和親權鑒定。

由于DNA檢材的狀況、基因組變異率、目的DNA片段的長度和完整性等都會影響到檢材PCR擴增的結果，因此，在對不同檢材進行DNA鑒定時，可依據檢材的狀況來選擇合適的目的基因。例如，野生動物類案件中的涉案生物檢材常為各種體液和組織，又經常處于陰暗潮濕、高溫或是日照強烈的露天環境，也常混雜污染物，很容易發生變質、降解、腐敗，DNA容易斷裂。對于這類的檢材，應選取小片段目的基因作為DNA條形碼。由于在對目的基因的PCR擴增產物進行測序并比對時，物種信息依賴于GenBank等數據庫中的關于該物種的信息量和準確性，因此，在選擇目的基因時，應盡量選擇生物信息豐富的基因。例如，cyt b基因擁有合適的進化速率和長度，是目前為止Genbank數據庫中線粒體基因研究數據最多并且在脊椎動物中被測序得最廣泛的基因，能充分滿足物種鑒定的要求，適合用于物種的DNA鑒定。此外，還應選擇合適的DNA提取方法，以保證獲得質量較好的DNA。

三、DNA條形碼技術在動物物證鑒定中的應用

我國素有食用、藥用、衣用、飼養和觀賞野生動物或其制品的傳統。改革開放以來我國經濟社會快速發展，各方面對野生動物的需求十分巨大，合法來源產品難以滿足需求。這促使了在一段時期內，非法狩獵或殺害珍貴野生動物以及非法收購、運輸、出售走私珍貴野生動物或其制品等犯罪活動愈演愈烈，使得生物多樣性和生態平衡遭到破壞和威脅，并可能導致偷漏稅費和疫病傳播等嚴重后果，危及國人健康，甚至影響中醫藥的可持續發展，使國家和民族形象受損。DNA條形碼技術是物種鑒定的有力工具，在打擊動植物犯罪中也起到了重要的作用。以筆者所在鑒定中心為例，近年來，DNA鑒定在動物物種鑒定中所占比例呈明顯上升趨勢，DNA條形碼技術可用于野生動物保護、中藥資源保護、食品安全監測、動物親子鑒定和個體識別、澄清案件性質等多個方面。

（一）動物種屬和種群鑒別

mtDNA在動物種屬鑒定方面有著很好的應用。例如，我國新疆地區分布有北山羊、高鼻羚羊、盤羊、巖羊、黃羊、鵝喉羚、馬鹿、駝鹿、狍等多種國家重點保護野生動物，同時牧民也有飼養家山羊、綿羊等牲畜。各種“羊”“羚”“鹿”在被去除了角、頭、蹄等特征性部位，并被剝皮、肢解后，很難區分。如果不能對涉案樣本進行準確的鑒定，會對案件的性質和案件偵破的方向造成重要影響。北山羊和家山羊同屬偶蹄目牛科山羊屬物種，親緣關系較近。筆者所在課題組研究發現，利用cyt b基因就可以很好的區分北山羊和家山羊這兩個不同物種。

2017年1月1日新修訂的《中華人民共和國野生動物保護法》第二十八條規定了“對人工繁育技術成熟穩定的國家重點保護野生動物的人工種群不再列入國家重點保護野生動物保護名錄，實行與野外種群不同的管理措施”的管理辦法；在2017年7月1日公布實施的第一批《人工繁育國家重點保護陸生野生動物名錄》中，就包括了梅花鹿、馬鹿等國家重點保護動物。正確區分國家重點保護野生動物的人工種群和野外種群，是查明野生動物產品來源、界定案件性質、防止非法來源的野生動物產品流入合法渠道的重要環節之一。研究表明，mtDNA的D-loop區有著較高的進化速率，能較好地區分動物亞種和不同來源的種群，為動物種群鑒定提供可靠的依據。

（二）動物制品種屬來源鑒定

以往各海關口岸對犀牛角、羚羊角等角制品的動物種屬來源鑒定主要依賴于形態學方法，在某些情況下經過訓練的技術人員使用關鍵的形態學特征就能進行常規鑒定工作，但大多數情況需要經驗豐富的分類專家，如果樣本經過人為加工、改造，使原動物制品失去了其關鍵形態特征，就會使分類專家很難對其進行準確鑒定。此外，形態鑒別特征常有的趨同和變異會導致物種間的鑒定誤差。DNA條形碼技術一定程度上能夠解決這個問題。由于特定的物種具有特定的DNA短片段序列信息，實際工作中，即使所需檢定的動物制品形式多種多樣、經過加工后的制成品與原來的形態有很大差別，絕大多數情況下DNA條形碼技術也能很好地實現對不同形式的動物制品的鑒定。由于DNA技術是可機械重復的，通過一套簡單實驗技術，經過簡單培訓的技術員即可操作。這樣的工作可投放到基層單位，且準確性高。

（三）混合肉制品鑒定

肉制品中動物源性成分的鑒定對野生動物保護、打擊食品摻假造假、保障消費者知情權均具有重要作用。由于食品中肉類經過加工過程后，常會改變原有的形態學特征、質地、氣味等，這增加了品種鑒定的困難。利用mtDNA特異性引物，能夠分析動物種類；結合復合PCR技術，用多對引物同時對多個基因目標區域進行擴增，可實現對肉制品中混合動物源性成分的區別和鑒定，準確高效，便于推廣。

（四）動物個體識別與親權鑒定

在我國走私、非法獵捕、殺害、收購、運輸、出售珍貴瀕危陸生野生動物重大案件、特別重大案件立案標準中，都涉及對保護動物數量的確定，而在涉及已肢解動物、動物制品的案件中，就很難通過常規的形態以及痕跡特征確定具體動物數量，這就對相關案件的立案、判決及后繼處理造成很大影響。STR和SNP在動物個體識別與親權鑒定方面的應用，就能很好地解決上述問題。

DNA條形碼技術將使執法、科研、檢疫檢驗工作更加高效，使過去專家才能掌握的知識更好地服務于大眾與社會。DNA條形碼技術能夠準確、快速地實現對動物源性成分的鑒定，為動物鑒定提供一種快速、靈敏的新方法，對相關監管部門、各檢驗機構對動物及其制品進行實際檢測研究提供了方法指導和技術支持，能夠彌補傳統檢測方法的缺陷，并為食品安全、野生動物保護和商品貿易提供有力的幫助，同時對保障廣大人民群眾的身體健康和生活質量，維護社會穩定和經濟發展都具有積極作用。此外，DNA條形碼技術在植物鑒定中也有很好的應用。總之，DNA條形碼技術有利于提高涉及動植物的案件中動植物物種鑒定的檢出率和準確性，揭示生物檢材與案件的內在聯系，為公安及相關部門執法辦案提供極大的便利，也為依法打擊相關違法行為提供有力的技術支持，具有廣闊的應用前景。