東北刺人參不定根提取工藝優化及其對酪氨酸酶活性的影響

蔣曉龍， 代 月， 金星愛， 樸炫春， 廉美蘭， 楊林先*

(1.延邊大學農學院，吉林延吉133002；2.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 龍井 133400)

東北刺人參(Oplopanaxelatus)為五加科多年生落葉灌木植物。是我國吉林省長白山區特種藥用植物之一，在俄羅斯遠東山區、朝鮮北部山區也有分布。近年來，由于其分布狹窄、野生資源日益減少，已處于瀕危狀態，被列為國家二級保護植物，吉林省一級保護植物[1]。東北刺人參中含有多種皂苷、揮發油、黃酮、蒽醌、脂肪酸等主要化學成分，對中樞神經系統、心血管系統、垂體、腎上腺皮質的功能具有一定影響, 同時具有抗炎、抗衰老、抗菌、解熱鎮痛的藥理作用[2]。

黑色素作為自然界中分布的色素之一，廣泛存在于動植物及人體中。黑色素可以對抗紫外線的輻射、調節體溫，并決定人體皮膚顏色。在遺傳、內分泌、炎癥介質、紫外線以及飲食不當等不同因素的影響下，皮膚黑色素增長過快、不均勻分布或色素異常代謝都會使局部色素沉積以及皮膚變黑，最終表現為不同種類的色斑以及色素沉著等[3]。酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)作為黑色素合成的主要限速酶，其活性大小直接決定黑色素合成的數量。近年來，人們廣泛地進行了酪氨酸酶活性抑制劑的相關研究，為色素沉著、黑色素瘤等色素疾病的預防和治療提供依據。天然植物因其顯著的效果和較低的毒副作用，已經成為化妝品研發的熱點[4]。對于東北刺人參，迄今尚未發現國內外用其提取物抑制黑色素生成的研究。因此，該試驗以生物反應器培養的東北刺人參不定根為材料，研究不同提取工藝條件對酪氨酸酶活性的抑制效果，篩選出最佳的提取工藝，為東北刺人參抗黑色素的深入研究及美白產品的開發提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

參照于丹等[5]的方法誘導和增殖東北刺人參不定根。取增殖的不定根20 g(鮮重)，切成1 cm大小后接種于含4 L培養基的5 L氣球型氣升式生物反應器中。培養基為MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L，pH值調節為5.8。反應器中通入75 mL/min的氣體，培養30 d后加入200 μmol的MeJA處理8 d。培養條件為溫度25 ℃，暗培養。不定根收獲后用自來水沖洗2～3次，瀝干表面水分，放入50 ℃的烘干箱中，烘干的不定根干品作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 東北刺人參不定根不同溶劑提取物的制備

取不定根干粉20 g，置圓底燒瓶內后分別加入80%甲醇、80%乙醇和水，料液比調節為1∶30。采用超聲提取法，在頻率為40 kHz和30 ℃(KH5200E，昆山禾創有限公司，中國)下提取1 h后過濾。共3次，3次濾液合并后置于旋轉蒸發儀(R201D II，上海申順生物科技有限公司，中國)，真空濃縮至膏狀。將膏狀物置烘箱(DHG-9123A，上海齊欣科學儀器有限公司，中國)中50 ℃下干燥至恒質量后稱重，計算提取率/%=[(提取物干浸膏質量/原干粉質量)×100 %]。

1.2.2 東北刺人參不定根乙醇提取物的提取工藝優化

1) 單因素試驗

將東北刺人參不定根干粉20 g浸泡在80%的乙醇中，研究在不同提取時間、溫度、次數和料液比條件下提取物對酪氨酸酶活性的影響。1) 提取時間試驗：將提取時間設置為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，在溫度為30 ℃，料液比為1∶30的條件下提取3次。其他提取物制備方法同1.2.1；2) 提取溫度試驗：將提取溫度設置為25、30、50、70和90 ℃，在時間為1.5 h，料液比為1∶30的條件下提取3次。提取物制備方法同1.2.1；3) 提取次數試驗：將提取次數設置為1、2、3、4和5次，在時間為1.5 h，溫度為50 ℃，料液比為1∶30的條件下提取。提取物制備方法同1.2.1；4) 料液比試驗：將料液比設置為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，在時間為1.5 h，溫度為50 ℃的條件下提取3次。提取物制備方法同1.2.1。

2) 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，設定4因素3水平L9(34)正交試驗(表1)，測定各提取物對酪氨酸酶活性的影響。

表1 正交試驗因素水平

3) 驗證試驗

按最佳提取工藝條件進行驗證試驗，重復3次，確定最佳工藝條件是否具有重現性以及穩定性。

1.2.3 酪氨酸酶活性測定方法

參照Chan等[6]的方法測定酪氨酸酶活性。按表2準確吸取東北刺人參不定根提取物溶液(0.4 mg/mL)、磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.8)和1 mmol/L L-多巴(Sigma公司，美國)溶液至96孔板中, 于室溫孵育10 min后, 加入50 U/mL的蘑菇酪氨酸酶(Sigma公司，美國)溶液，5 min后用酶標儀(Bio-Rad公司，美國)在492 nm處測吸光值(OD)，并計算酪氨酸酶的抑制率。酪氨酸酶活性抑制率/%=[1-(ODA1-ODA2)/(ODA3-ODA4)]×100%

表2 反應液的組成

2 結果與分析

2.1 東北刺人參不定根不同溶劑提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果

通過對甲醇、乙醇和水提取物對酪氨酸酶活性抑制率測定的結果，發現乙醇提取物對酪氨酸酶活性抑制力達到68.9%，高于水提及甲醇提取物(表3)。因此，后續試驗都選擇乙醇作為提取溶劑。

表3 東北刺人參提取物對酪氨酸酶活性的抑制率

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取時間對酪氨酸酶活性的影響

提取時間從0.5 h上升到1.5 h時，東北刺人參提取物對酪氨酸酶活性抑制率逐漸增加，當提取時間為1.5 h時，東北刺人參提取物對酪氨酸酶活性抑制率達到最高，為51.7 %(圖1)。提取時間繼續增加時，酪氨酸酶活性抑制率則下降，說明提取時間過長可能會導致東北刺人參提取物中對酪氨酸酶抑制作用的有效成分有破壞作用。因此，適宜的提取時間范圍確定為0.5～1.5 h。

圖1 提取時間對酪氨酸酶活性抑制率的影響

2.2.2 提取溫度對酪氨酸酶活性的影響

提取溫度對東北刺人參提取物對酪氨酸酶活性抑制率影響較大。在提取溫度為50 ℃時，東北刺人參提取物對酪氨酸酶活性抑制能力達到最高，能夠達到53.8%，但超過50 ℃時，抑制能力開始下降(圖2)。說明溫度過高會導致東北刺人參提取物中的抑制成分發生氧化或水解反應，從而降低對酪氨酸酶活性的抑制能力。

圖2 提取溫度對酪氨酸酶活性抑制率的影響

2.2.3 提取次數對酪氨酸酶活性的影響

東北刺人參提取物對酪氨酸酶活性的抑制率在提取次數3次以內隨次數的增加呈上升趨勢，提取3次時，酪氨酸酶活性抑制率最高為53.5%，超過3次后則出現下降趨勢，抑制率低于1次提取物(圖3)。考慮到提取時溶劑成本及時間，選擇提取次數不超過3次較為合適。

圖3 提取次數對酪氨酸酶活性抑制率的影響

2.2.4 料液比對酪氨酸酶活性的影響

提取時，不定根干品質量與乙醇體積比，即料液比對酪氨酸酶活性的抑制力有較大影響。料液比從1∶10增加至1∶20時，酪氨酸酶活性抑制率增加，但超過1∶20時，酪氨酸酶抑制率下降(圖4)。

圖4 料液比對酪氨酸酶活性抑制的影響

這表明當料液比為1∶20時，原料中抑制酪氨酸酶活性的物質可充分得到提取，繼續提高料液比，只增加了提取成本，對酪氨酸酶活性的抑制效果不及1∶20的料液比。因此，選用1∶20的料液比較適宜。

2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，采用L9(34)正交設計對提取時間(A)、提取溫度(B)、提取次數(C)和料液比(D)進行不同組合，研究了這些組合對酪氨酸酶活性抑制率的影響(表4)。

表4 正交試驗方案及結果

表4中第7組，即提取時間1.5 h、提取溫度30 ℃、提取3次、料液比1∶20，酪氨酸酶活性的抑制率達到71.2 %，高于其他8個組。對極差R進行分析的結果，R值由高到低的順序為提取時間(A)(32.0)>料液比(D)(25.6)>提取溫度(B)(20.3)>提取次數(C)(13.3)，這種結果表明，4種因素對酪氨酸酶活性抑制的強度不同，提取時間的影響最大，之后依次是料液比、提取溫度和提取次數。對各因素水平酪氨酸酶抑制率的平均值K進行分析的結果，提取時間(A)中K3值最大，料液比(D)中K2值最大，而提取溫度(B)和提取次數(C)中K3值最大，因此，最佳工藝條件可確定為A3D2B3C3，即：提取時間1.5 h、料液比1∶20、提取溫度70 ℃、提取次數3次。

2.4 驗證試驗

對正交試驗得到的最佳工藝條件(A3D2B3C3)進行3次重復性驗證試驗，結果發現，酪氨酸酶活性的平均抑制率為77.6%(表5)，高于正交試驗中酪氨酸酶抑制率最高的第7組(71.2 %)。試驗結果的相對標準偏差(RSD)為1.9%，表明該優選工藝穩定可行。

表5 驗證試驗結果

3 討論與結論

近年來，由于人為大量采挖，東北刺人參資源短缺，使其開發利用受到阻礙。生物反應器是一種可以大量培養植物細胞、組織或器官的設備，目前已應用于人參[7, 8]、東北刺人參[9]等五加科植物的細胞和不定根培養中。其中,培養的人參細胞和不定根也已作為原材料用于藥品、保健品及化妝品等產業中。化妝品市場上的美白產品大多數是以抑制酪氨酸酶活性為原理進行生產。目前，許多產品中化學合成的酪氨酸酶抑制劑如熊果苷、曲酸等的應用越來越廣泛[10]，但這種化學合成物質的毒副作用、安全性成為評價化妝品的一個重要指標。植物提取物安全，且具有明顯的美白、護膚等作用。研究表明，高良姜多糖[11]、柿子葉粗提物[12]、甘草黃酮[13]、葡萄籽原花青素[14]、蘆薈皮提取物[15]和白芨提取物[16]等對酪氨酸酶均具有較強的抑制作用，具有較好的美白功效。

超聲提取法是一種廣泛應用于植物有效成分提取的方法，提取工藝的優化對于有效成分的提取起著至關重要的作用。劉文靜等[17]研究了利用超聲提取法對藍莓酒渣中多酚提取工藝進行優化，結果證明優化后的多酚提取率明顯提高，達到8.89 mg/g；曹榮安等[18]對白鮮皮多糖的提取條件進行優化，在最佳條件下，多糖得率達到7.1 %；春英等[19]對蓖麻堿的提取工藝進行優化，結果發現液料比1∶10，提取溫度95 ℃，提取時間1 h，為最佳提取工藝，超過此值影響蓖麻堿的提取效果；謝遠紅等[20]對竹葉黃酮的提取工藝進行了優化，研究發現超聲波功率150 W，超聲時間12 min，料液比1∶50 g/mL，乙醇濃度40 %，此時竹葉黃酮得率最高，達到3.93 %。

植物中有效成分的提取方法對酪氨酸酶活性的影響很大，許多研究者通過提取條件的改善，確定最佳的提取工藝，但不同植物、不同溶劑的提取條件不同。宋艷玲等[21]研究表明，獨角蓮水提物對酪氨酸酶活性抑制的最佳提取工藝為料液比1∶15，提取時間3 h，提取溫度80 ℃，提取次數1次，此時抑制率為46.9%。龔盛昭等[22]研究表明，白蒺藜水提物對酪氨酸酶活性抑制的最佳提取工藝為料液比10∶1，微波450 W 提取，抑制率為43.8%。該試驗中東北刺人參不定根乙醇提取物在提取時間1.5 h，料液比1∶20，提取溫度70 ℃，提取次數3次的條件下，對酪氨酸酶活性抑制能力最強，為77.6%。因此，東北刺人參不定根可作為美白化妝品產業的一種較好的原材料，本研究對東北刺人參資源的開發及利用提供了參考依據。

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