CAR-T在晚期肺癌治療中的研究進展①

劉 睿 李亞榮

(吉林大學第二醫院腫瘤血液科，長春 130012)

1 CAR-T的發展歷程及現階段臨床應用

1890年COLEY毒素的治療拉開了腫瘤免疫治療序幕，20世紀50年代，Burnet等闡釋了免疫監視學說，指出腫瘤的形成是免疫逃逸的結果。2002年，Dunn等[1]在此基礎上提出了腫瘤的免疫編輯學說。提出細胞毒性T細胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)在腫瘤的免疫應答中起關鍵作用。特異性抗原(如腫瘤細胞表面抗原)經抗原提呈細胞(Antigen presenting cells，APC)的攝取、加工、提呈后，與MHCⅠ類抗原形成MHC-抗原肽復合物。此種復合物與CTL的特異性識別受體(T cell receptor，TCR)結合后，從而實現抗腫瘤免疫應答。而腫瘤細胞通過分泌VEGF、TF-P、IL-10等細胞因子，以及下調腫瘤細胞表面MHC類分子或T細胞活化所需共刺激分子的表達，阻止了APC的成熟分化，干擾正常呈遞過程，實現了免疫逃逸[2]。抗原嵌合受體T細胞(CAR-T)通過基因轉染技術使T細胞表面表達靶細胞的抗原受體，以抗原特異性的方式和非HLA依賴的方式識別腫瘤細胞表面抗原并有效殺傷靶細胞[3]。

2 抗原嵌合受體T細胞(CAR-T)的主要結構

抗原嵌合受體主要由四部分組成，包括細胞外抗原結合區、鉸鏈區、跨膜區和細胞內信號轉導區[4]。抗原結合區由識別腫瘤相關抗原(Tumor associated antigen，TAA)的特異性單克隆單鏈抗體(single chain Fv domain,scFv)構成，實現了對腫瘤細胞的特異性殺傷[5]。鉸鏈區(也被稱為間隔區)由CD8、CD28或IgGFc段構成，這一結構擴大了T細胞表面的抗原結合域。跨膜區由Ⅰ型跨膜蛋白(如CD4、CD8、CD28等)形成的跨膜序列組成。細胞內信號轉導區主要由0～2個活化T細胞所需的共刺激分子[如:CD28、CD-134(OX40),CD137]以及CD3ζ構成，主要負責激活下游信號通路，引起T細胞的增殖和活化[6]。CAR-T的結構經歷了如下四代變革。1988年，Finney等[7]構建了第一代CAR-T，主要由scFv與胞內單一信號分子CD3ζ構成。一代CAR-T與靶抗原結合后，使CD3ζ鏈的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosinebas-ed activating motif,ITAM)磷酸化，與胞質蛋白酪氨酸激酶(PTK)Zap-70結合從而啟動TCR，使T細胞停留在G-G1期。但因缺乏共刺激分子的協助無法活化，故不能進一步發揮抗腫瘤功能。

隨后，研究人員在一代CAR-T的基礎上加入了1個共刺激分子信號轉導域，研究最廣泛的共刺激分子是CD28。Barbara等[8]的研究證明含有CD28胞內結構域的CAR-T細胞有更強的增殖能力和持久性。Maher等[9]的實驗證明含有CD28的前列腺特異性膜抗原(PSMA)二代CAR與第一代抗PSMA CAR相比，能釋放更多的IL-2因子，引發更強的抗原抗體反應，持續裂解PSMA陽性的靶細胞。研究人員在間皮瘤腫瘤模型中發現[10],含CD137(4-1BB)的二代CAR-T與含CD28的二代CAR-T相比，有同等的抗腫瘤效果。同時發現含有CD137共刺激分子的CAR可減少CAR-T細胞的凋亡，促進抗凋亡蛋白(例如Bcl-xL)的表達，以及殺傷腫瘤細胞相關細胞因子的生成。

為了進一步優化CAR-T細胞的功能，研究人員設計出了含有兩個共刺激分子的CAR-T細胞。Zhong等[11]在抗前列腺特異性膜抗原模型中發現含CD28/4-1BB/CD3ζ的三代CAR，能增加細胞因子的生成，以及體內CAR-T細胞存活率，提高抗腫瘤能力，激活PI3K/AKT通路，上調Bcl-xL的表達，減少CAR-T細胞凋亡。Pule等[12]的實驗含有CD28/OX-40/CD3ζ的第三代CAR-T有更強的體外增殖力，以及在重復抗原刺激后持續裂解腫瘤細胞的能力。 Wilkie等[13]在MUC1-CAR的實驗中發現含有CD28/OX-40/CD3ζ的三代CAR-T體外分泌IFN-γ的能力更強。

目前，研究人員正在進行四代CAR-T(TRUCKs)的研究[14]。通過在第三代CAR-T的基礎上轉染IL-12編碼基因，增強CAR-T細胞釋放IL-12的能力，促進巨噬細胞及NK-T細胞向腫瘤組織的趨化及遷移，增強對腫瘤細胞的殺傷能力[15]。

3 CAR-T細胞現階段臨床應用

3.1血液系統疾病 近期的研究表明，CAR-T細胞治療血液系統惡性腫瘤的成功率非常高，特別是B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)。研究表明，應用CAR-T細胞療法治療的患者，甚至是異體造血干細胞術后的患者，完全緩解(CR)率可達70%～94%[16-18]。此外賓夕法尼亞大學針對B-CLL的第一個臨床研究也獲得了較好的結果，三名使用抗CD19的CAR-T細胞治療的難治性晚期CLL患者中,兩名患者達到完全緩解(CR)[19]。四年后，同一研究組的ORR達57%[20]。在這些積極的結果影響下，近年來大量針對血液系統抗原如CD19、CD20、CD22、CD30的CAR-T細胞的臨床試驗正如火如荼的展開。相關結果提示，CAR-T細胞療法在霍奇金淋巴瘤(HL)、B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、多發性骨髓瘤(MM)及急性髓性白血病(AML)的治療中同樣很有發展前景[21-24]。

3.2實體瘤 迄今為止，CAR-T細胞在血液系統惡性疾病的治療中取得令人欣喜的成果。在此基礎上，CAR-T細胞用于治療實體瘤的研究逐步開展起來。研究較多的實體瘤類型有：乳腺癌、膠質瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神經母細胞瘤等。研究較多的靶點有：癌胚抗原(CEA)用于治療結直腸腺癌、成纖維細胞活化蛋白(FAP)用于治療惡性胸膜間皮瘤，雙神經節苷脂GD2用于治療神經母細胞瘤，人表皮生長因子受體2(HER2)用于治療HER2陽性腫瘤，間皮素用于治療胰腺癌，白細胞介素13受體α(IL-13Rα)用于治療神經膠質瘤等[25-30]。

然而大部分實驗結果并未達到我們的預期，實體瘤的CAR-T細胞療法療效遠不及血液系統惡性腫瘤。實體瘤和血液系統惡性腫瘤間存在如下差異：首先，血液腫瘤通常較彌散，而實體瘤在早期即在某一器官或組織內形成較為聚集的團塊。其次，血液腫瘤的表面靶抗原較為一致，且大多數惡性細胞都攜帶有靶抗原；相反，實體瘤表達的抗原異質性較大，不僅不同實體瘤細胞表達的抗原不同，同種實體瘤的不同階段所表達的抗原也有差異，因此不易找到特異性的靶點。實體瘤周圍存在免疫抑制微環境(Immunosup-pressive tumor microenvironment TME)，抑制過繼轉移的T細胞向病灶內遷移。總之，CAR-T細胞療法針對實體瘤的治療技術尚不成熟，仍需進一步的研究及試驗。

4 CAR-T細胞療法在肺癌中的應用

肺癌是全球男性癌癥相關死亡的首要原因，是女性癌癥死亡的第二大原因[31]。由于缺乏特異性臨床表現，多數患者確診時已屬于中晚期。盡管在過去的幾十年中，包括手術、化療、放療、靶向治療等綜合治療方法的實施，已在很大程度上改善了患者無病生存期和總生存期，但5年生存率僅19%。隨著腫瘤生物學研究的進步，以及對肺癌發病機制的進一步認識，肺癌的免疫治療近年來應運而生。目前主要有兩個研究方向：一是以CTLA-4抗體和PD-1/PD-L1抗體為代表的阻斷免疫檢查點的封鎖療法，免疫檢查點抗體通過解除腫瘤細胞對T細胞的抑制,激活T細胞功能,恢復T細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。二是以CAR-T細胞療法為主的過繼細胞免疫療法。后文將闡述CAR-T細胞治療肺癌的現狀及問題。

5 CAR-T治療肺癌的主要靶點

5.1內皮生長因子受體EGFR 表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)顯著表達于各種實體腫瘤的細胞膜表面，特別是在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中。EGFR過表達影響腫瘤細胞生長、腫瘤血管生成、以及腫瘤的侵襲和轉移。 EGFR作為人類腫瘤診斷和治療靶點的潛在價值已經被認識了數年。Feng等[32]的實驗中觀察到11名晚期復發/難治性NSCLC患者在接受抗EGFR CAR-T細胞治療后均未出現明顯毒副反應，2例患者達到部分緩解(PR)，5例患者疾病穩定(SD)期達2～8個月。取PR或SD患者的腫瘤組織活檢做免疫組化，結果證實以EGFR為靶點的CAR-T細胞可以浸潤腫瘤組織，誘發EGFR特異性細胞毒性。這意味著抗EGFR的CAR-T細胞可以通過TME，發揮免疫殺傷腫瘤細胞的功能。

5.2酪氨酸激酶受體EphA2 Eph是受體酪氨酸激酶(RTKs)家族中最大的一類[33]。EphA2在許多發育過程中起著關鍵作用，并與許多癌癥有關[34]。EphA2在超過90%的非小細胞肺癌中過表達，但在正常肺組織中不表達。研究表明EphA2的過表達與K-RAS基因突變陽性患者的不良預后密切相關[35]。Ning等[36]的研究證明抗EphA2 CAR-T細胞在與EphA2陽性靶標共培養時可通過產生細胞因子IFN-γ引起腫瘤細胞裂解，并且在體外實驗證明細胞毒性效應是特異性的。體內實驗同樣發現以EphA2為靶點的CAR-T細胞的顯著抗腫瘤活性。約有15%的肺癌患者在初診時出現胸腔積液，50%的患者在進展后出現胸腔積液[37,38]。該項研究中指出抗EphA2 CAR-T細胞可以注入胸腔內治療EphA2陽性的惡性胸腔積液患者，后續的研究已經開始。

5.3黏蛋白1(Mncoprotein，MUC1) MUC1是一種跨膜蛋白,與腫瘤的黏附和轉移密切相關。降低腫瘤細胞之間直接黏附，使之脫落種植。同時增強腫瘤細胞與內皮細胞的黏附,介導腫瘤細胞轉移[39,40]。MUC1在正常肺組織的表達極低，但腫瘤發生時則顯著過表達。Wei等[42]應用NSCLC的PDX小鼠模型證實，以MUC1為靶標的CAR-T細胞對腫瘤細胞有特異性殺傷能力。MUC1可以作為小細胞肺癌免疫治療的可靠靶點。為目前開展的針對抗MUC1 CAR-T細胞的臨床試驗(NCT02587689)奠定了基礎。

5.4人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2) HER2是腫瘤相關抗原，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、惡性腫瘤中顯著表達。而在正常組織中不表達或極少表達[42]。已有研究證實，抗HER2的CAR-T細胞在HER2陽性的腫瘤患者中有顯著的抗腫瘤療效[43]。為肺癌的治療提供了新思路，目前國內已開展抗HER2 CAR-T細胞治療肺癌的臨床Ⅰ期研究(NCT02713984)。

5.5間皮素(Mesothelin,MSLN) MSLN是一種細胞表面糖蛋白，在多種實體腫瘤的細胞表面均質表達，但在肺癌和胃癌中，不僅表達細胞表面，也表達于腫瘤細胞的細胞質內。多項抗MSLN CAR-T細胞治療實體瘤的臨床研究正在開展(NCT01583686、NCT02414269、NCT02580747)。Adusumilli等[44]建立了惡性胸膜間皮瘤原位小鼠模型，在這個模型中，給予全身或胸腔局部的抗MSLN CAR-T細胞。胸腔給藥組的CAR-T細胞增殖能力、存活能力以及腫瘤細胞殺傷能力高于全身給藥組的30倍。抗MSLN CAR-T細胞的胸腔局部應用促進了早期的抗原反應，增加細胞因子分泌，活化免疫相關T細胞。此外，該項實驗還發現胸腔內給予的抗MSLN CAR-T細胞可以在體內長期存在，并在殺滅腫瘤細胞后的200 d中持續抑制腫瘤細胞的復發。在這些發現的基礎上，一項針對間皮瘤、肺癌和胸膜轉移的乳腺癌患者的抗MSLN CAR-T細胞局部Ⅰ期研究已經開展(NCT0241426)。

上述靶點為現有治療肺癌的主要研究方向，除此之外，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3也被證實是肺鱗狀細胞癌CAR-T細胞療法的新型潛在靶點[45]。隨著研究深入會有更多的靶點應用于肺癌的過繼細胞療法中，如KRAS、c-MET、BRAF等。

6 CAR-T治療肺癌的問題

CAR-T細胞輸注后最常見最嚴重的副作用是細胞因子風暴(Cytokine release syndrome，CRS)。由于嵌合抗原受體與相應的腫瘤相關抗原特異性結合，引發大量細胞因子釋放，級聯激活多類免疫反應[46]。主要臨床表現是高熱、高血壓、呼吸困難甚至多器官衰竭[47]。David等[48]提出了一種預測CRS的算法，指出輸注后第一個月內IFN-γ、IL-6、sgp130和sIL-6R的峰值水平可作為sCRS的標準指標。后續的研究表明，IL-6受體拮抗劑能在不影響CAR-T細胞功能前提下有效地控制CRS[49]。

其次，脫靶效應也是常見的不良反應。理想的CAR-T細胞靶點是在腫瘤細胞中高表達，而在正常組織中不表達或低表達的抗原。脫靶效應指的是CAR-T細胞發揮細胞毒性的過程中識別正常機體的抗原導致機體正常組織器官的損傷。解決脫靶問題，應在尋找更安全的靶點同時，可以通過降低單鏈抗體的結合力減輕免疫反應[50]，同時應用抑制性CAR，調控CAR-T細胞的活性[51]。為提高CAR-T細胞安全性。研究人員提出了自殺基因療法，即在CAR-T細胞中引入相關基因，使表達這些修飾基因的細胞會被分泌的細胞毒性物質殺死，進而避免潛在的毒副作用。目前證實效果較好的基因有可誘導性Caspase-9(iC9)、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)以及EGFR阻斷基因。其他人工干預CAR-T細胞凋亡途徑的研究也正在展開，有望解決相關問題。

肺癌作為實體瘤的一種，存在腫瘤免疫抑制微環境(Tumor microenvironment,TME)，TME影響CAR-T細胞的活化，抑制其殺傷腫瘤的功能。研究人員發現聯合應用PD-1/PD L1抗體能有效地解決這一問題[52]。另外，研究人員設計了同時針對VEGF-2及IL-2的CAR-T細胞[53]，能夠增強CAR-T細胞浸潤至腫瘤組織的能力。

7 展望

近年來，隨著對肺癌發生發展機制研究的逐漸深入，推出了許多新的治療手段。CAR-T細胞療法作為肺惡性腫瘤治療，近年來雖然取得了一定進展，但仍有許多問題亟待解決。通過尋找更準確的靶點，進一步明了CAR-T細胞療法的機制和降低CAR-T細胞療法所帶來的副作用，制定出個體化的治療方案。有理由相信，CAR-T細胞療法將會給廣大的肺癌患者帶來生存上的獲益。