血液系統惡性腫瘤相關外泌體研究進展①

李偉偉 李歸冀 樊 華 李劍平

(沈陽中心血站(遼寧省血液中心)，沈陽 110044)

外泌體越來越多地被認為是疾病的生物標志物和預后因子而進行廣泛研究。外泌體應用在血液系統惡性腫瘤的診療研究方面進展迅速，研究熱點主要集中在：外泌體在腫瘤發生發展中的作用機制，外泌體miRNA與腫瘤發生發展的相關性，外泌體介導的腫瘤細胞的免疫逃逸，外泌體作為腫瘤診斷的生物標志物和外泌體相關的腫瘤化療耐藥等幾大方面。本文將就血液系統惡性腫瘤外泌體的最新研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

外泌體(Exosomes)，也被稱為細胞外囊泡(small extracellular vesicle,sEV)是一種在生理和病理情況下由細胞分泌的直徑30～120 nm，富含蛋白質、脂質和RNAs等分子，具有脂質雙層膜結構微小膜泡[1-3]。是在真核細胞內的多泡小體中形成分泌囊泡的一種亞型[4]，當這些多泡小體與質膜融合時分泌到細胞外。雖然囊泡亞型的研究越來越細化，但由于檢測手段的限制，研究者們仍多將上述直徑范圍內的各亞型分泌囊泡統稱為外泌體[5]。

外泌體具有靶向輸送的能力，且其脂質雙層膜結構是內包被物的天然保護屏障。生理情況下可通過受體介導的交互作用直接刺激靶細胞[6]，或通過向靶細胞轉移各種生物活性分子，參與原核生物和高等真核生物細胞之間的生物信號傳遞，發揮其生物學功能[7，8]。隨著近幾年外泌體研究的不斷深入，發現在腫瘤疾病狀態下，機體細胞分泌的外泌體其組分、數量和功能與生理條件下相比都會發生改變：腫瘤細胞分泌的外泌體可包含腫瘤特異性蛋白和RNAs分子等，大部分腫瘤細胞分泌數量更多的外泌體顆粒，腫瘤細胞外泌體參與腫瘤細胞間信息傳遞與免疫調節，腫瘤外泌體可作為腫瘤疾病診斷的生物標志物。

在血液系統惡性腫瘤中，腫瘤細胞分泌的外泌體(Tumor-derived exosomes,TEX)重新編程腫瘤微環境，抑制機體抗白血病免疫，介導腫瘤耐藥并干擾機體免疫治療和參與血液腫瘤惡性轉化，因此TEX被視為抗血液系統惡性腫瘤的有希望的生物標志物和潛在治療靶點。

2 外泌體的分離提取與鑒定

2.1外泌體的分離提取 外泌體的純度是外泌體相關研究中最重要的問題。外泌體研究的關鍵步驟是如何從不同樣本中獲取一定濃度的高純度的外泌體樣本。外泌體的富集主要有傳統的高通量方法和較新的微流控、非接觸和免疫吸附法等。傳統的高通量方法主要包括：超速離心法、沉淀法、分子排阻法和場流分級法等，目前較多采用的提取方法有高速離心法、沉淀試劑盒法等。梯度密度離心法是公認的獲取高純度外泌體的方法，但是操作相對復雜[9，10]；沉淀試劑盒法實驗操作相對簡單但外泌體純度一般，其沉淀物中多有鐵蛋白、病毒顆粒等存在，電鏡檢測時較難觀察到典型的茶托樣具有清晰膜結構的納米粒子外泌體圖像[11，12]。

2.2外泌體的鑒定 外泌體的鑒定是外泌體分離獲取后的重點和難點問題，只有經過多種方法鑒定均滿足外泌體標準的沉淀獲取物才可以被稱為外泌體而進行下游實驗。精準和絕對的外泌體尺寸規范還沒有明確定義。2006年，外泌體領域專家第一次發表了膠體金電鏡顯示的典型外泌體形態結構圖[13]，至今仍然為外泌體研究者們提供了經典的研究方法和圖像參考。

目前為止，外泌體純度、活性和提取鑒定標準仍以實驗室標準為主。外泌體鑒定的常規方法包括：透射電鏡進行外泌體結構觀察、沉淀物粒子直徑測量和Western blot檢測外泌體蛋白，當透射電鏡無法觀察到外泌體典型形態時，需加做免疫膠體金電鏡實驗進行進一步觀察。透射電鏡可以觀察到外泌體為茶托樣具有清晰的膜結構；粒子直徑分析系統測量顆粒物直徑在30～120 nm之間(多數小于100 nm)；Western blot檢測CD81、CD63和Hsp70等多種外泌體標志蛋白均陽性表達；免疫膠體金電鏡觀察到免疫膠體金顆粒較牢固的吸附于外泌體膜結構表面。目前研究者們已經建立了專門針對細胞培養上清、新鮮血漿和凍存血漿外泌體提取方案[14]，可重復、大規模和高通量的臨床級外泌體生產純化方案[15]，并采用電鏡、納米粒徑分析和蛋白印跡等方法對沉淀物進行檢測，均取得了較好的實驗效果。

3 外泌體與血液系統惡性腫瘤

3.1白血病 白血病是血液系統高發的惡性腫瘤疾病，早期發現、早期診斷對指導患者臨床用藥、靶向治療和判斷疾病預后都具有重要臨床意義。

3.1.1急性骨髓性白血病 急性骨髓性白血病是(Acute myeloid leukemia，AML)是一種造血干細胞或祖細胞分化受阻并無序增殖的惡性血液系統疾病，若不采取有效治療則會迅速進入骨髓衰竭期[16]。然而人類對此病的微環境調控機制仍知之甚少。最新研究證實AML通過分泌外泌體將骨髓微環境重建成有利于白血病細胞生長和抑制正常造血功能的微環境[17]，AML衍生的外泌體通過抑制正常造血因子DKK1的表達和誘導骨髓基質細胞中的造血干細胞促進因子(CXCL 12、KITL和IGF1等)廣泛下調，而營造有利于白血病細胞增殖和存活的微環境[18]。AML外泌體還可以促進健康造血干細胞生存并誘導白血病樣功能特征，使miR21和miR29等過表達[19]。外泌體不但在腫瘤微環境構建中發揮重要作用，還介導干細胞與腫瘤細胞之間的信息傳遞，白血病干細胞源性外泌體可以促進AML細胞的增殖、遷移并抑制腫瘤細胞凋亡。

3.1.2急性淋巴細胞白血病 急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是兒童白血病的主要類型且目前治愈成功率較高，但患兒仍然要承受多次重復骨髓活檢所帶來的巨大痛苦。原發性ALL和相應細胞系腫瘤細胞都會釋放具有完整細胞器和組織細胞骨架的膜結構大囊泡，是介導細胞間通訊的重要結構介質[20]。研究人員還依據ALL外泌體包含肌動蛋白等囊泡分支結構，建立了一種對患者血液中的ALL外泌體進行追蹤的實驗技術，為急性粒細胞白血病的診斷、藥物治療和顯著減輕患兒痛苦提供了啟示[21]。該技術的建立為腫瘤外泌體是否可以提供腫瘤個性化信息及后續能否以此為依據開展個性化治療提供了較好的科研思路和實驗基礎。

3.1.3慢性淋巴細胞白血病 慢性淋巴細胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL)是成人常見的血液系統惡性腫瘤，外泌體相關研究主要集中在外泌體介導骨髓基質與CLL腫瘤細胞之間信息交換、生物標志物鑒定、免疫逃逸、惡性轉化和化療耐藥等幾大方面。

外泌體在慢性淋巴細胞白血病B細胞與骨髓微環境之間通訊具有關鍵作用[22，23]：通過對外泌體在CLL與微環境的相互作用關系進行深入研究發現，一方面CLL外泌體通過調節AKT信號轉導通路，誘導VEGF等CLL促進因子高表達，進行腫瘤微環境調節；另一方面，微環境中骨髓基質細胞來源外泌體能夠增強CLL B細胞的遷徙能力和化療耐藥性，并幫助CLL白血病細胞逃離自發或藥物誘導凋亡。

CLL相關外泌體還參與腫瘤患者機體免疫調節。CLL小鼠單核細胞和巨噬細胞表面攜帶較多PD-L1受體，其衍生的外泌體RNA促進CLL患者單核細胞免疫抑制表型蛋白程序性死亡配體1(PD-L1)的表達，PD-L1免疫抑制點的調節為CLL患者供了一種新的免疫治療預選方案[24]。研究者們對外泌體作為CLL物標志的研究較深入，CD19+、CD37+、CD52+外泌體和miRNA155+等均是CLL臨床分期和指導用藥的較好指標，含有CLL“白血病”轉錄物的外泌體還能夠將其相關miRNA向健康間充質基質細胞傳遞，使其惡性增殖轉化。

3.2淋巴瘤

3.2.1非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin′s lymphoma,HL)是血液系統腫瘤研究較深入的一種高發性淋巴瘤，1997年以CD20為靶點的非霍奇金淋巴瘤靶向藥(也是人類歷史上的首個癌癥靶向藥)——利妥昔單抗(Rituxima)在美國獲批上市，從此癌癥的靶向治療進入了一個全新的快速發展階段[25]。通過大樣本臨床試驗發現，非霍奇金B細胞淋巴瘤患者血漿外泌體中含有C-MYC、BCL-XL、PTEN、AKT和BCL-6等多種mRNAs，是對腫瘤一線藥物治療無效的統計學顯著性預測因子，可以對腫瘤進行檢測和預后判斷[26]：C-MYC mRNA與患者無進展生存期負相關；首次復發和疾病進展期患者外泌體BCL-XL和PTEN mRNA低表達；BCL-6 mRNA的表達含量與患者死亡率正相關，上述多種外泌體相關標志物的鑒定為非霍奇金淋巴瘤的診斷和治療奠定了基礎。而當腫瘤中外泌體CD20陽性表達時，外泌體可以截獲Rituximab，使抗體與靶細胞的結合率降低，幫助腫瘤細胞免疫逃逸[27]。

3.2.2霍奇金淋巴瘤 霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma,HL)是較高發的中老年血液系統腫瘤，埃博斯坦巴爾病毒(EBV)檢測多為陽性表達[28,29]。研究證實EBV可以通過其外泌體途徑使腫瘤中的巨噬細胞感染病毒并加速淋巴瘤的發展進程[30]。

3.3血液系統其他惡性腫瘤 多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者循環外泌體miRNA對患者診斷和預后判斷具有指導意義。MM患者血清中檢測到外泌體存在，且通過實時定量PCR技術共分析了外泌體中22個miRNA，發現let-7b和miR-18a與患者無進展生存期和總生存期顯著相關[31]。骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)患者外泌體可以通過傳遞miRNA、mRNA和蛋白質等介導骨髓基質與腫瘤細胞之間的信息交通[32]。與正常造血細胞相比較，IL-3受體在慢性粒細胞白血病(Chronic myelocytic leukemia，CML)母細胞中過表達，可作為靶向給藥的靶標。與傳統直接給藥組相比較，通過改造外泌體使其靶向CML-IL3R遞送抗腫瘤藥物-伊馬替尼，外泌體給藥組可明顯抑制腫瘤細胞生長[33]。

4 結語與展望

研究表明外泌體在血液系統惡性腫瘤發生發展中發揮著重要作用，尤其是各種外泌體相關腫瘤生物標志物的成功鑒定為無創液體活檢提供了廣泛可能。如何生產出安全、靶向能力強、易于獲取和高純度的臨床級別外泌體仍是外泌體研究領域的重點。雖然研究人員不斷創新，建立了可以循環利用細胞培養液連續生產高濃度的細胞外泌體的中空纖維生物反應器和基于超順磁納米粒子簇快速獲取高純度外泌體的新方法[34]，但總體來講，仍存在很大局限性和不確定性，有關外泌體活體回輸后遠期效應的研究仍較少涉獵，其免疫調節能力也仍需進一步廣泛深入研究[35]。隨著不斷深入的研究，以外泌體為基礎的診療體系必將會不斷完善，將為廣大血液病腫瘤患者診斷、治療和預后開辟了新的臨床診療視角。