高產紅曲色素和Monacolin K紅曲霉菌的誘變選育

常聰，張安，程述敏，張文學

(四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065)

紅曲是以大米為發酵基質，接種紅曲霉菌，經發酵而得的一種色澤為紫紅色的產物[1]。我國對紅曲霉的應用歷史悠久。紅曲霉代謝產物繁多[2]，而紅曲色素和Monacolin K是2種重要的代謝產物[3]。紅曲色素作為天然優質食用色素，具有抗突變、防腐等作用[4,5]，在食品、醫藥等行業應用較廣；Monacolin K能抑制人體膽固醇合成[6]，被認為是最佳的血脂調節物。目前國內外以同時提高二者產量為目的的誘變育種研究較少，而我國工業化生產紅曲色素和Monacolin K普遍存在成本高、產量低的問題，因此提高紅曲霉菌株發酵產紅曲色素和Monacolin K的能力具有重要的現實意義。誘變育種是利用合理有效的誘變劑及誘變劑量處理微生物的單細胞，提高突變頻率，再通過適當的篩選方法獲得優質菌株的育種方法[7]。因此，文章采用對紅曲霉單孢子懸液進行紫外線-氯化鋰的復合誘變方法，對平板菌落初篩，對紅曲色素、Monacolin K含量檢測進行復篩，并進行遺傳穩定性實驗，旨在篩選出同時高產紅曲色素和Monacolin K及具備良好遺傳穩定性的紅曲霉突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

從本實驗室、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)共購買收集5株紅曲霉菌株(QH，JP2，5046，40225，40938)。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 種子液培養基

馬鈴薯20%，無水葡萄糖2%，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 大米培養基

大米經清洗，于水中浸泡1 h，瀝干水分，進行蒸煮至大米顆粒分散、微粘狀態。蒸煮后的大米分別取30 g分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

色譜純：甲醇、磷酸；分析純：甲醇、無水葡萄糖、無水乙醇、無水氯化鋰。

1.1.4 主要儀器設備

單人雙面凈化工作臺、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺式高速冷凍離心機、高效液相色譜儀、電熱恒溫真空干燥箱、恒溫振蕩培養箱、酶標儀、電子天平、磁力攪拌器、超聲清洗機、可調萬用電爐、電磁爐、蒸鍋、40目篩等。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲米制作方法

1.2.1.1 種子液

將紅曲霉斜面孢子刮下置于三角瓶中，振蕩充分，無菌脫脂棉過濾孢子液，將孢子稀釋至濃度約為 106～107個/mL，即為孢子懸液，2%接種量接種于種子液培養基中，120 r/min搖床28 ℃培養48 h。

1.2.1.2 固態發酵紅曲米

將種子液按照10%(V/V)接種量接種于裝有30 g大米培養基的250 mL三角瓶中，并用無菌玻璃棒打散，于28 ℃培養14天。

1.2.2 紅曲中Monacolin K的檢測方法[8，9]

將紅曲發酵產物于40 ℃下烘干研磨至40目，稱取0.5 g于50 mL容量瓶中，加入適量無水甲醇，室溫下超聲1 h，中間間歇振蕩3～4次最終定容到50 mL。以4000 r/min的轉速離心10 min。取上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液取20 μL經HPLC測定方法檢測，并根據HPLC標準曲線計算內酯式及酸式Monacolin K含量，并計算Monacolin K總含量。HPLC檢測方法參考QB/T 2847-2007。

1.2.3 紅曲中紅曲色素的檢測方法[10]

紅曲色素提取及檢測方法參考GB 1886.19-2015。

稱取0.2 g烘干研磨后的紅曲發酵產物，用70%乙醇溶液溶解并將其轉入100 mL容量瓶中，定容，置于(60±0.5) ℃水浴中，浸泡1 h，冷卻至室溫，補充70%乙醇溶液至刻度，混勻后過濾，吸取一定體積的濾液于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液稀釋定容至50 mL，搖勻，在505 nm的波長下測定處理后樣品的吸光度A，并計算樣品的色價。

式中：A為樣品吸光度；m1為樣品質量(g)；V為吸取乙醇浸泡液的體積(mL)。

1.2.4 紅曲霉菌株產紅曲色素和Monacolin K能力的測定

對5株紅曲霉(QH，JP2，5046，40225，40938)的固態發酵產物進行Monacolin K和紅曲色素的提取及檢測。比較5株紅曲霉固態發酵產紅曲色素和Monacolin K能力，選擇最優紅曲霉菌株作為后續實驗菌株。

1.2.5 誘變方法

1.2.5.1 紫外誘變

在避光的無菌操作臺中，將裝有5 mL制備好的單孢子懸浮液的無菌培養皿放置于磁力攪拌器上，將滅過菌的攪拌轉子放置于培養皿中，開啟攪拌器，使單孢子懸浮液一直保持攪拌狀態，在紫外燈(25 W)下，保持垂直照射距離20 cm，將培養皿分別照射1，2，3，4，5 min。避光下將不同紫外誘變劑量的單孢子菌懸液分別稀釋至10-3，取各誘變后的單孢子菌懸液及其稀釋液0.1 mL涂平板，每個樣品做3個平行。未經誘變的原菌液稀釋同等梯度涂平板作為空白對照。平板靜置20 min后于28 ℃恒溫培養室中倒置培養3天左右，避光培養，以免發生光復活作用。待菌落生長出來觀察并記數，計算致死率。一般來說，為了提高誘變成功率，應采取較高致死率的平板菌落繼續進行后續實驗，但過高致死率平板上的突變菌株容易發生回復突變的情況，性狀不穩定。因此，選取致死率在70%～80%的平板的誘變劑量作為最佳誘變劑量。

式中：A為對照組菌落數；B為誘變組菌落數。

1.2.5.2 紫外-氯化鋰復合誘變

將上述紫外誘變后的孢子懸浮液分別吸取0.1 mL涂布于氯化鋰濃度分別為0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰的PDA平板上，每個梯度3個平行，并以不含氯化鋰的PDA平板作為對照組。將以上PDA平板于28 ℃恒溫培養室倒置培養3天。觀察并記錄菌落數，計算不同誘變劑量的致死率。

1.2.5.3 突變菌株篩選方法

初篩方法：以原始菌株菌落形態作為對照，選取最佳誘變劑量下的誘變菌落中，菌落直徑、菌落顏色、菌絲疏密程度等與原始菌落有區別者，進行平板劃線分離，獲得突變單菌落。

復篩方法：初篩得到的單菌落接種于斜面PDA培養基中，28 ℃培養7天后轉入種子液培養基中培養2天后，進行固態發酵培養14天，檢測發酵產物中紅曲色素和Monacolin K的含量，篩選出高產紅曲色素和Monacolin K的突變菌株。

1.2.5.4 誘變菌株的遺傳穩定性實驗

將紫外-氯化鋰復合誘變處理后，篩選得到的高產Monacolin K紅曲霉突變菌株轉接至斜面PDA培養基中，28 ℃恒溫培養7天后作為第1代，第1代斜面菌落轉接至新的斜面PDA培養基中，28 ℃恒溫培養7天后為第2代，以此類推到第5代。每一代的紅曲菌株都需進行固態發酵，發酵14天后檢測紅曲色素和Monacolin K的含量，篩選出遺傳穩定性最高的菌株。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉菌株產Monacolin K能力的測定

對5株初始紅曲霉菌株(QH，JP2，5046，40225，40938)紅曲色素和Monacolin K產量進行測定，見表1。

表1 5株初始紅曲霉紅曲色素色價和Monacolin K含量Table 1 Levels of Monascus pigments and Monacolin K in 5 original Monascus strains

注：“—”為未檢出。

其中紅曲霉QH的紅曲色素相對較高，色價達1330 U/g，Monacolin K產量最高，為0.36 mg/g。后續將選用該菌株作為原始菌株，進行復合誘變育種高產Monacolin K菌株。

2.2 最佳誘變條件的確定

通過平板菌落計數，計算不同誘變劑量下的紅曲霉菌致死率，制作誘變劑量與致死率的相關曲線，從而確定紫外-氯化鋰的最佳復合誘變條件。

2.2.1 紫外誘變劑量的選擇

圖1 紫外誘變時間對紅曲霉菌QH致死率的影響Fig.1 Effect of ultraviolet mutation duration on the lethal rate of Monascus QH

由圖1可知，紫外誘變劑量達到2 min時，紅曲菌致死率達到75%，所以確定2 min為紫外誘變的最佳誘變劑量。

2.2.2 紫外-氯化鋰復合誘變劑量的選擇

圖2 氯化鋰濃度對紅曲霉菌QH致死率的影響Fig.2 Effect of LiCl concentration on the lethal rate of Monascus QH

由圖2可知，氯化鋰濃度達到0.6‰時，紅曲霉菌致死率達到78%，所以確定氯化鋰濃度為0.6‰作為復合誘變處理劑量。

2.2.3 紫外-氯化鋰復合誘變篩選結果

2.2.3.1 誘變菌株初篩

選取最佳誘變劑量——紫外誘變2 min、氯化鋰濃度0.6‰的平板菌落作為誘變菌落，誘變前后的紅曲霉菌菌落形態對比見圖3。

圖3 誘變前后紅曲霉菌落形態對比Fig.3 Colonial morphology of Monascus before and after mutation

注：左表示未經誘變，右表示紫外-氯化鋰復合誘變后。

由圖3可知，紫外-氯化鋰復合誘變后的菌落形態與原始菌落形態有一定差別：誘變后的菌落直徑較大，且邊緣白色菌絲所占面積較未經誘變的菌落小，而中心橙紅色部分菌絲所占面積較未經誘變的菌落大。挑選與原始菌落差別較大的單菌落進行平板劃線分離及PDA斜面保藏。

2.2.3.2 誘變菌株復篩

經菌落形態初篩，獲得紫外-氯化鋰復合誘變菌株50株，編號為QH1～QH50，分別對其進行固態發酵并測定發酵產物中紅曲色素和Monacolin K的含量，檢測其是否高于原始菌株QH的色素和Monacolin K產量，若高于原始菌株QH則為正突變。50株紅曲霉誘變菌株的代謝能力不一，有的突變株產量提高，有的突變株產量降低。紅曲色素和Monacolin K產量同時提高最多的突變菌株見表2。

表2 誘變菌株QH12，QH14，QH46 紅曲色素和Monacolin K含量及提高值

由表2可知，突變株QH12，QH14，QH46的紅曲色素及Monacolin K產量較原始菌株均有所提高，紅曲色素色價分別達到2450，3190，1960 U/g，是原始菌株的1.84，2.40，1.47倍；Monacolin K分別達到1.68，1.28，1.99 mg/g，是原始菌株的4.67，3.56，5.53倍，可見紫外-氯化鋰復合誘變紅曲菌株的產紅曲色素和Monacolin K能力好。

2.2.4 誘變菌株的遺傳穩定性實驗

誘變后的突變菌株性狀不穩定，培養過程中會出現突變性狀衰退甚至消失，從而不能應用于工業生產，故要對突變菌株進行傳代穩定性試驗。對3株紅曲菌突變株QH12，QH14，QH46分別連續傳代4次，進行固態發酵實驗并檢測其紅曲色素和Monacolin K產量，每次3個平行，取平均值，結果見表3。

表3 紅曲霉菌誘變菌株產紅曲色素和Monacolin K的情況Table 3 Production of Monascus pigments and Monacolin K in mutant strains

由表3可知，突變株每次傳代后的紅曲色素和Monacolin K產量均低于第1代突變株，降低幅度不定。兩種產物綜合考慮，其中QH12突變株降幅均較小，遺傳性能比較穩定，因此選擇該菌株作為繼續研究的菌株。

方春玉等[11]采用物理(紫外、超聲波、微波)誘變和化學(氯化鋰)誘變相結合的方式對紅曲進行誘變，誘變菌株產紅曲色素的能力提高了約3倍。孫嘉龍等[12]采用紫外線照射45 s、氯化鋰1.0‰的誘變劑量對紅曲菌株進行復合誘變，篩選出高產Monacolin K的紅曲突變菌株，其Monacolin K產量是原始菌株Monacolin K含量的3.3倍，且連續傳接4代Monacolin K產量穩定。羅定軍等[13]將Monacolin K產生菌采用紫外線(UV)和氯化鋰(LiCl)對其原生質體進行復合誘變，經原生質體再生，獲得高產菌株BTL23，BTL56，Monacolin K的產量比原來提高23.3%，并將高產菌株BTL23成功用于紅曲Monacolin K的實際生產。而本研究采用紫外誘變2 min、氯化鋰濃度0.6‰對紅曲霉菌株QH進行復合誘變，得到高產紅曲色素和Monacolin K且遺傳性能穩定的突變菌株QH14，與以上研究結論有異曲同工之處，故說明采用紫外-氯化鋰對紅曲霉菌株進行復合誘變是合理、有效、有依據的。

3 結論

本文對5株原始紅曲霉菌產紅曲色素和Monacolin K的能力進行測定，其中紅曲霉QH的紅曲色素較高，Monacolin K產量最高，對其進行紫外-氯化鋰復合誘變篩選高產紅曲色素和Monacolin K的突變菌株。得到最佳誘變條件：紫外誘變時長2 min，氯化鋰濃度0.6‰。經過菌落形態初篩，紅曲色素和Monacolin K含量檢測復篩，以及遺傳穩定性實驗，得到了高產紅曲色素和Monacolin K且遺傳穩定性能好的突變菌株QH12，其紅曲色素色價達到2450 U/g，是原始菌株的1.84倍；Monacolin K產量達到1.68 mg/g，是原始菌株QH的4.67倍，兩種代謝產物較原始菌株均有所提高。本文為高產紅曲色素和Monacolin K工程菌株提供了有效的菌種資源，對紅曲中色素和Monacolin K的學術研究具有意義。

[1]李東,謝靜,王敏,等.紅曲起源新考[J].中藥材,2007,30(4):484-487.

[2]童群義.紅曲霉產生的生理活性物質研究進展[J].食品科學,2003,24(1):163-167.

[3]李雪梅,沈興海,段震文，等.紅曲霉代謝產物的研究進展[J].中草藥,2011,42(5):1018-1025.

[4]翟鵬貴,趙珺彥,周大興，等.中藥紅曲復方制劑降脂作用的實驗研究[J].浙江中醫藥大學學報,2012,36(1):70-72.

[5]王玲,吳軍林,吳清平.紅曲降血脂功能的研究及應用概況[J].食品工業科技,2014,35(8):387-390.

[6]Endo A.Monacolin K,a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglu-larylcoenzyme A reductase[J].Antibitics,1980,33(3):334-336.

[7]曹軍衛,馬輝文.微生物工程[M].北京:科學出版社,2002.

[8]朱效剛.紅曲功能性成分分析及發酵法生產的研究[D].無錫:江南大學，2005.

[9]胡文效,魏彥鋒，蔣錫龍，等.高產Monacolin K紅曲霉菌種的誘變選育及液態發酵工藝優化[J].食品工業科技,2013,34(24):296-301.

[10]GB 1886.19-2015,食品添加劑 紅曲米[S].

[11]方春玉,周健,鄧靜，等.高產紅曲色素的紫紅紅曲霉誘變育種技術研究[J].中國釀造,2008,27(23):19-21.

[12]孫嘉龍，鄒曉，劉愛英，等.高產Monacolin K紅曲菌株的復合誘變選育[J].菌物學報,2007,26(4):507-516.

[13]羅定軍,周興挺.洛伐他汀產生菌原體質體誘變育種及發酵配方優選的研究[J].中國抗生素雜志,2000,25(5):339-340.