百里香黃酮微膠囊的制備及抑菌活性研究

王娣，柯春林，謝海偉，曹珂珂，李妍，許暉

(蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香(Thymusmongolicus)屬唇形科屬，在我國主要分布于長江以北區域，國際標準化組織(ISO)確定它為食品調味品之一[1-4]，可用于烹飪時除腥提鮮，有較高的食用價值。國內外學者研究發現百里香屬植物莖葉中富含黃酮、百里香酚等活性成分，可用于醫藥、食品等領域[5-9]。但百里香活性成分易受外界環境影響而揮發和氧化，限制了其在食品工業中的應用。微膠囊技術使囊心被壁材包埋，與外界環境隔離，免受不良因素造成的影響[10-14]。酵母細胞是天然微膠囊原料，小分子物質可以滲透進入細胞形成微膠囊[15]。本文以安琪酵母為壁材，采用響應面試驗優化百里香黃酮微膠囊制備工藝，研究不同因素對其微膠囊形成的影響，并對黃酮微膠囊進行抑菌作用初探，以期為百里香活性物質的提取利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香(市售，含水量10.5%)：粉碎過篩(60目)備用；聚酰胺樹脂(30～60目)：國藥集團化學試劑有限公司；安琪活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蘆丁標品(純度≥95%)、無水乙醇(分析純)、氯化鈉(分析純)：中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。

大豆油：實驗室自榨提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)：蚌埠學院生物工程實驗中心微生物實驗室保藏；單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，編號：1.10753)：中科院微生物所購買；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

AB323電子天平 上海海康電子儀器廠；XFB-200高速中藥粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠；CHR-ST冷凍干燥機 德國Christ公司；MZKR022-R高速冷凍離心機 德國Hettich公司；SHA-B恒溫震蕩器 常州電器有限公司；DL-360A超聲清洗器 上海之信儀器有限公司；RE200B旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；YXQ-LS-50G滅菌鍋 上海博訊有限公司；SHP-250生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 百里香黃酮提取液制備和含量測定

1.3.1.1 百里香黃酮提取液的制備

準確稱取10.0 g 百里香粉，加入70%乙醇，超聲波50 ℃輔助提取百里香黃酮，抽濾后的濾液經聚酰胺樹脂分離純化，90%乙醇洗脫，40 ℃旋轉蒸發濃縮至10 mL備用。

1.3.1.2 百里香黃酮含量的檢測

a.標準曲線的制定

準確稱取蘆丁標準品0.020 g，用30%乙醇定容至100 mL容量瓶中。吸取蘆丁標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，各加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液6 min(還原)，加0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液6 min(絡合)，再加4 mL 1 mol/L NaOH溶液，用30%乙醇定容于10 mL容量瓶中，搖勻顯色15 min，510 nm處測吸光度[16]。得蘆丁標準曲線回歸方程y=0.0115x+0.0063，R2=0.9997，具有良好的線性關系，見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

b.黃酮提取液含量檢測

準確吸取樣液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按步驟a測定吸光度，計算得到黃酮含量。

1.3.2 百里香黃酮微膠囊的制備

1.3.2.1 酵母細胞預處理

稱取一定量的安琪活性干酵母，加入10倍量的5% NaCl溶液，50 ℃水浴恒溫振蕩24 h，離心，無菌水洗3次，冷凍干燥，備用。

1.3.2.2 百里香黃酮微膠囊的制備方法

將百里香黃酮濃縮液按比例加入預處理好的酵母細胞中，恒溫振蕩，離心，無菌水洗3 次，冷凍干燥得百里香黃酮微膠囊。

1.3.3 黃酮微膠囊的制備工藝優化

1.3.3.1 單因素試驗

以包埋率為指標，研究不同芯壁比、包埋時間以及包埋溫度對百里香黃酮微膠囊制備的影響。

a.芯壁比對包埋率的影響

以1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1 不同的芯壁比(g/g)將百里香黃酮濃縮液加到預處理后的酵母中，40 ℃恒溫水浴振蕩6 h，5000 r/min離心10 min，冷凍干燥，測定百里香黃酮包埋率。

b.包埋時間對包埋率的影響

以芯壁比3∶1(g/g)將百里香黃酮濃縮液加入預處理后的酵母中，40 ℃恒溫振蕩2，4，6，8，10 h，5000 r/min離心10 min，冷凍干燥，測定百里香黃酮包埋率。

c.包埋溫度對包埋率的影響

以芯壁比3∶1(g/g)將百里香黃酮濃縮液加到預處理后酵母中，不同溫度30，40，50，60，70 ℃下振蕩6 h，5000 r/min離心10 min，冷凍干燥，測定百里香黃酮包埋率。

百里香黃酮包埋率=1-未包埋的游離黃酮量加入的總黃酮量×100%。

1.3.3.2 響應面試驗優化

采用Design-Expert V8.0.6軟件，在單因素試驗基礎上，以芯壁比(A)、包埋時間(B)、包埋溫度(C)為自變量，百里香黃酮包埋率為響應值，進行Box-Behnken試驗設計，三因素三水平響應面試驗見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 百里香黃酮微膠囊抑菌活性研究

接種斜面細菌菌落至50 mL滅菌冷卻的TSB中，120 r/min 37 ℃培養過夜，取0.1 mL培養液接入10 mL TSB中繼續培養8 h，得到對數生長期細胞，離心后用pH 7.2的PBS(0.01 mol/L)洗滌2次，懸浮菌體濃度至106～107cfu/mL備用。精確稱取百里香黃酮微膠囊5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg，紫外滅菌20 min，置于10 mL菌懸液中處理10 min，以不加微膠囊作為對照處理，處理后的液體吸取0.10 mL稀釋液涂布于TSA平皿中(n=3)，37 ℃培養24 h，計算菌落數，計算百里香黃酮微膠囊的抑菌率。

抑菌率(%)=空白平均菌落數-微膠囊處理后平均菌落數空白平均菌落數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖2 芯壁比對百里香黃酮包埋率的影響Fig.2 The effect of ratio of core material and wall material on embedding rate of thyme flavonoids

由圖2可知，芯壁比(g/g)的變化對百里香黃酮包埋率的影響較大，隨著芯壁比的增大，包埋率出現快速上升，到3∶1 時包埋率最大，達到飽和。綜合考慮，選擇芯壁比3∶1左右為宜。

圖3 包埋時間對百里香黃酮包埋率的影響Fig.3 The effect of embedding time on embedding rate of thyme flavonoids

由圖3可知，隨著包埋時間的延長，百里香黃酮的包埋率呈上升趨勢，在6 h 時百里香黃酮的包埋率達到最高，之后趨于穩定，基本保持不變。綜合考慮，選取包埋時間6 h 左右為宜。

圖4 包埋溫度對百里香黃酮包埋率的影響Fig.4 The effect of embedding temperature on embedding rate of thyme flavonoids

由圖4可知，隨著包埋溫度的增加，百里香黃酮包埋率先略上升后下降，可能是開始時擴散速率隨著溫度的升高而增大，導致包埋率出現上升，而當溫度繼續升高超過50 ℃時，高溫使部分酵母細胞蛋白質變性失活，同時高溫對百里香黃酮可能也有一定程度的破壞，因此，選取40 ℃左右為宜。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 The experimental design and results for response surface experiment

2.2.2 數型的建立與響應面方差分析結果

采用Design-Expert V8.0.6軟件對響應面試驗數據進行分析，得到的百里香黃酮微膠囊包埋率與各因變量的模擬方程為：Y=68.24+0.96A+0.46B-0.48C-2.31A2-1.50B2-0.84C2-0.39AB-0.050AC-0.83BC。回歸方程拋物面開口向下，具有極大值點，可以對百里香黃酮微膠囊工藝條件進行優化[17,18]。方差分析結果見表3。

表3 二次響應面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

注：*，P<0.05表示差異顯著；**，P<0.01表示差異極顯著。

由表3可知，該回歸模型的P<0.0001，極顯著；方程失擬項值為0.0805>0.05，不顯著，說明該模型與實際情況擬合度比較好，可以代替試驗真實點對百里香黃酮微膠囊工藝試驗結果進行分析和預測。R2=0.9795說明該回歸模型的擬合度比較好；模型調整系數RAdj2=0.9532，說明該模型的實際值與預測值之間相關性較好；模型精密度為19.959，說明該模型是可行的[19]。由表3中F值的大小判斷各因素對百里香黃酮微膠囊包埋率影響的強弱，F值越大，對包埋率影響作用越強[20-23]。各因素影響大小為A(芯壁比)>C(包埋溫度)>B(包埋時間)。其中A對百里香黃酮包埋率的影響極顯著(P<0.01)，B，C對百里香黃酮包埋率的影響顯著(P<0.05)。

2.2.3 響應面優化分析

等高線圖能直觀反映影響因素之間交互作用是否顯著，圓形表明交互作用不顯著，橢圓形則表明交互作用顯著[24]。等高線和響應面圖見圖5。

圖5 各因素交互對百里香黃酮包埋率影響的等高線和響應面圖

由圖5中a可知，隨著芯壁比和包埋時間的增加，百里香黃酮包埋率先升高后緩慢降低。適當地增大芯壁比可以提高百里香黃酮包埋率。由圖5中b可知，隨著芯壁比與包埋溫度的增加，百里香黃酮包埋率同樣出現先增加后下降的趨勢。由圖5中c可知，隨著包埋時間和包埋溫度的增加，百里香黃酮包埋率先快速增加后下降。

2.2.4 驗證試驗

利用Design-Expert V8.0.6軟件預測百里香黃酮微膠囊制備的最優工藝條件為芯壁比3.19∶1，包埋時間6.48 h，包埋溫度35.9 ℃，在此條件下百里香黃酮微膠囊包埋率理論上可達68.49%。為操作方便，將最佳工藝條件修正為芯壁比3∶1，包埋時間6.5 h，包埋溫度36 ℃，百里香黃酮微膠囊包埋率平均值為(68.50±0.36)%(n=3)，與預測值接近。

2.3 百里香黃酮微膠囊的抑菌活性研究

百里香黃酮微膠囊的抑菌作用見表4～表6。

表4 百里香黃酮微膠囊濃度對金黃色葡萄球菌抑制率的影響Table 4 Effect of thyme flavonoid microcapsule content on inhibitory rate of S.aureus

表5 百里香黃酮微膠囊濃度對單增李斯特菌抑制率的影響Table 5 Effect of thyme flavonoid microcapsule content on inhibitory rate of L.monocytogenes

表6 百里香黃酮微膠囊濃度對大腸桿菌抑制率的影響Table 6 Effect of thyme flavonoid microcapsule content on inhibitory rate of E.coli

試驗結果顯示：百里香黃酮微膠囊對3種常見食品污染菌均有一定抑制作用。當微膠囊量添加較小時，對E.coli和L.monocytogenes的抑制效果均不明顯；但隨著百里香黃酮微膠囊濃度的增加，對S.aureus，E.coli和L.monocytogenes的抗菌能力在逐漸增強。經SPSS 20.0統計分析，不同濃度的百里香黃酮微膠囊對3種細菌抑制率的影響具有顯著差異(P<0.05)。當黃酮微膠囊濃度達到20 mg/mL時，對S.aureus，E.coli和L.monocytogenes的抑制率(%)分別為98.50±0.07，87.10±0.05和93.20±0.13，再繼續增加黃酮微膠囊的量，細菌抑制率增加不明顯。數據分析對比得出：在黃酮微膠囊濃度相同時，對S.aureus的抑制率要比E.coli和L.monocytogenes的抑制率高，黃酮微膠囊對細菌的抑菌效果大小為：S.aureus>L.monocytogenes>E.coli。

3 結論

采用響應面試驗對百里香黃酮微膠囊進行制備，結果表明芯壁比對包埋率的影響最大，芯壁比>包埋溫度>包埋時間，得到百里香黃酮微膠囊制備最優條件為芯壁比3∶1，包埋時間6.5 h，包埋溫度36 ℃，包埋率為(68.50±0.36)%(n=3)。百里香黃酮微膠囊抑菌作用研究表明：百里香黃酮微膠囊對S.aureus，E.coli和L.monocytogenes均有一定抑制作用，抑制作用大小為S.aureus>L.monocytogenes>E.coli。

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