甜面醬保溫發酵過程中醬醪的理化分析

張晶，葉碧霞，左勇*，謝光杰，張鑫，孫時光

(1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川化工職業技術學院，四川 瀘州 646000)

甜面醬是以面粉為原料，經微生物發酵釀制而成的半固態調味品，其味甜咸適宜，鮮味濃郁，深受廣大消費者喜愛[1]。甜面醬的生產可概括為前期制曲、中期拌鹽水以及后期發酵[2]。傳統的自然曬露發酵方式生產的甜面醬，其成品顏色鮮艷，口感細膩，酯香濃郁，但由于生化反應緩慢，發酵周期較長，需12個月左右才能使面醬成熟，從而影響企業產能的進一步提升。研究表明：可對傳統的生產方式進行改進[3，4]，通過添加酶制劑及人工保溫發酵，能夠縮短生產周期，但其成品質量不及傳統自然曬露方式所生產的甜面醬[5]。據報道[6，7]，基于傳統自然曬露以及人工保溫發酵兩種方式提出的先保溫后曬露的生產方式用于生產甜面醬，在縮短生產周期的同時，可彌補人工保溫所造成的品質不足的缺陷，因而具有應用前景。

目前，對于先保溫后曬露發酵方式的研究處于起步階段，其工藝有待進一步探究。通過對甜面醬在保溫發酵過程中的揮發性風味物質形成時期研究表明，發酵后期為甜面醬保溫發酵中主體風味物質的形成時期[8]。本研究將通過對不同發酵時間段的醬醪進行理化分析，初步探究大分子物質快速降解的階段，并以其作為分段依據，為兩段式發酵技術中最佳保溫發酵時間的確定提供理化指標等參考依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

人工保溫發酵的甜面醬樣品，發酵時間以拌鹽水入池為0天計算。人工保溫發酵周期通常是60天，拌鹽水后每隔1周需進行倒醅，以達到大分子物質的充分降解。結合類似研究，故取樣時間設置為0，5，10，15，20，25，30，35，40，47，54，60天。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；pH酸度計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠。

2 試驗方法

2.1 理化指標測定

含水量的測定：采用快速水分含量測定儀；總酸及氨基酸態氮的測定：采用直接滴定法以及甲醛滴定法；還原糖含量的測定：采用斐林法[9]。

2.2 酶活力測定

淀粉酶活力的測定：采用碘量法；中性蛋白酶以及酸性蛋白酶活力的測定：依據國標法[10]。

2.3 數據處理

試驗數據均采用SPSS 19.0軟件進行分析，采用Duncans新復極差法進行多重比較[11]。在0.05水平上檢驗試驗結果差異顯著性，試驗結果采用Origin作圖。

3 結果與分析

3.1 甜面醬保溫發酵過程中含水量的變化情況

保溫發酵過程中，水分含量直接影響微生物的生長代謝，同時也影響各種酶活力的大小，監測含水量的變化情況能夠實時反映發酵是否正常。水分含量的變化情況見圖1。

圖1 保溫發酵過程中含水量的變化Fig.1 Changes of moisture content at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標準偏差(n=3)；不同字母表示含水量存在顯著性差異(P<0.05)。

由圖1可知，隨著保溫發酵時間的延長，醬醪中水分含量逐漸降低。含水量從最初的43.9%降低至成熟時的38.96%。造成含水量下降的原因有：其一，保溫發酵溫度通常控制在38～45 ℃以實現大分子物質的快速降解，高溫使得水分蒸發；其二，發酵過程中微生物的生長代謝及相關化學反應會消耗一定的水分。

3.2 甜面醬保溫發酵過程中總酸與pH的變化情況

由于酸度直接影響酶活力，也會影響微生物的生長分布情況，從而影響物質的代謝以及轉化，生產上常會通過監測發酵醬醪的酸度變化情況來調整溫度。甜面醬保溫發酵過程中總酸以及pH值的變化情況見圖2。

圖2 保溫發酵過程中總酸和pH的變化Fig.2 Changes of total acid and pH values at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標準偏差(n=3)；不同小寫字母表示總酸含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示pH值差異顯著(P<0.05)。

由圖2可知，醬醪中總酸含量隨著發酵的進行逐漸上升，pH值則反之。保溫發酵0～20天，醬醪酸度快速上升，從0.67%上升到1.42%；同時，醬醪pH值則由5.7降低到4.9。發酵過程中，酸度的變化一方面源自于微生物發酵產生的有機酸，另一方面則是由原料中蛋白質降解生成的游離氨基酸帶來[12]。研究表明[13]：醬類發酵過程中，酸度的變化與乳酸菌的作用密切相關，發酵初期，乳酸菌快速繁殖同時大量產酸。保溫20～35天左右時，醬醪中的總酸含量約為1.48%(P>0.05)，醬醪pH值由4.9下降到4.33。保溫發酵35～60天，甜面醬中酸度變化幅度減緩，從1.48%上升到1.8%，增加了0.32%，較之于保溫前期酸度增加趨勢減慢，醬醪pH值由4.33下降到3.82。其原因可能是酸度的積累一定程度上會抑制產酸細菌的增長，從而反饋調節酸度的增加，部分酸作為中間代謝物質參與到其他化學反應中轉化為其他的物質，從而使得酸度增加趨勢減緩。

3.3 甜面醬保溫發酵過程中還原糖含量與淀粉酶活力的變化情況

甜面醬中還原糖主要來源于原料中淀粉等大分子物質在淀粉酶等作用下水解生成糊精、麥芽糖以及葡萄糖等小分子物質，進而參與到酒精及乳酸發酵等多種化學反應中。還原糖的含量可在一定程度上反映原料中糖類物質的降解程度，還原糖含量與淀粉酶活力變化見圖3。

圖3 保溫發酵過程中還原糖含量與淀粉酶活力的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content and amylase activity at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標準偏差(n=3)；不同小寫字母表示還原糖含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，保溫發酵過程中，甜面醬中還原糖含量隨著保溫時間的延長而逐漸上升直至穩定，而淀粉酶的活力則逐漸下降。保溫發酵0～20天，還原糖含量由18.75%增加到25.65%，增幅達6.95%，該階段還原糖含量顯著增加(P<0.05)，淀粉酶活力從最初的158.99 U/g干基下降到61.29 U/g干基。可能原因在于：拌鹽水初期，相對大的鹽含量及曲料拌和不均帶來的氧氣傳遞受阻等使得制曲階段所富集的霉菌在此階段生長代謝受阻出現大量消亡，但其所分泌的糖化酶適于在中性及偏酸性的環境中發揮作用，pH值的適當降低對糖化酶活影響不大，因此發酵前期糖化酶類繼續發揮作用，快速催化淀粉等多糖類物質水解為小分子類還原糖，從而使得還原糖含量快速增加。保溫發酵20～40天，還原糖含量上升至27.3%，此階段增幅約為1.65%；保溫發酵40～60天，甜面醬中還原糖含量基本維持穩定，約為27.3%(P>0.05)。結合數據分析可知，20天后，其含量增幅減小，原因可能在于：隨著發酵的進行，原料中淀粉類物質降解仍繼續，但水解生成的還原糖部分充當碳源供微生物生長代謝，同時部分還充當底物參與到酒精、乳酸等發酵賦予甜面醬甜味，以及參與醬醪色素成分如氨基糖、焦糖等的合成，從而導致還原糖含量上升緩慢。

整個保溫發酵過程中還原糖含量以及淀粉酶活力的變化情況表明，保溫發酵0～20天，此階段可以視為甜面醬中淀粉等大分子物質快速降解的時期，此后還原糖含量雖然也有增加，但上升趨勢減緩，該研究結果與張靜等[14]的研究結果相一致。從淀粉類降解情況而言，保溫發酵20～40天，此階段甜面醬中的淀粉類大分子糖類物質已經最大程度地降解為還原糖類小分子，40天后隨著保溫發酵繼續進行，其含量不再顯著性增加。綜上，保溫發酵20～40天后則可以終止保溫發酵階段，進入曬露發酵階段。

3.4 甜面醬保溫發酵過程中氨基酸態氮含量與蛋白酶活力的變化情況

添加鹽水進行保溫發酵，此階段醬醪環境呈酸性(pH 4～5)，故保溫階段中主要考慮中性蛋白酶以及酸性蛋白酶的活力。氨基酸態氮主要源自于蛋白酶水解蛋白質生成，其含量可反映蛋白質的水解程度[15]。甜面醬保溫發酵過程中氨基酸態氮與蛋白酶活力變化情況見圖4。

圖4 保溫發酵過程中氨基酸態氮與蛋白酶活力的變化Fig.4 Changes of amino nitrogen content and protease activity at different insulation fermentation time

注：誤差線表示標準偏差(n=3)；不同小寫字母表示氨基酸態氮含量存在顯著性差異(P<0.05)；不同大寫字母表示酸性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；不同希臘字母表示中性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知，隨著發酵的進行，氨基酸態氮含量逐漸上升，而兩種蛋白酶活力均快速降低。由于醬醪環境偏酸性，此條件下酸性蛋白酶活力高于中性蛋白酶活力。保溫發酵0～20天，醬醪中的氨基酸態氮含量從0.22%上升到0.37%，增加了0.15%，該階段氨基酸態氮含量顯著變化(P<0.05)。原因可能是制曲階段霉菌所分泌的蛋白酶在發酵前期起到水解蛋白的作用，中性蛋白酶將原料中的蛋白質分解為不同大小的肽類，酸性蛋白酶作為一類肽酶則可進一步將肽類降解為游離氨基酸[16]，從而使得前期氨基酸態氮的含量快速積累。保溫發酵20～40天，其含量從0.37%緩慢上升為0.39%，增幅較小，約為0.02%；保溫發酵40～60天，其含量則略有降低。通過多重比較分析各時期甜面醬中氨基酸態氮含量差異性可知，其含量在發酵前期及中期存在顯著性差異，發酵后期略有下降但基本維持穩定。可能原因在于：發酵后期水分含量減少，高鹽以及偏酸的發酵環境使得蛋白酶的活力降低，同時一部分氨基酸經脫羧、脫氨基后參與其他化合物的合成相關反應中，消耗掉醬醪中的部分氨基酸，故導致其含量增幅較小。

從保溫發酵整個過程來看，保溫發酵0～20天，氨基酸態氮含量變化較大(P<0.05)，該階段為原料中蛋白質的快速降解階段，隨著保溫進行，氨基酸態氮含量亦有增加，但增加趨勢減緩。20～40天甜面醬中的蛋白質最大程度地得到降解。發酵40天后，氨基酸態氮含量基本保持不變。結合保溫成本考慮，保溫發酵20～40天后則可以終止保溫發酵階段，進入曬露發酵階段。

3.5 甜面醬保溫發酵過程中醬體感官變化情況

甜面醬發酵過程中，甜面醬的外觀形態變化一定程度上反映發酵進行的程度。甜面醬保溫過程中感官變化情況見表1。

表1 保溫發酵過程中甜面醬的感官記錄Table 1 Sensory analysis records of sweet flour paste at different insulation fermentation time

由表1可知，醬體顏色與發酵時間呈正相關性；香氣則從發酵初期無明顯的香氣到后期醬香、酯香味突出；醬醪滋味隨著發酵進行，甜、鮮味愈來愈強，咸味則是從拌入鹽水后就一直存在；醬醪體態在拌鹽水初期，存在較大面疙瘩，隨著發酵進行，面團逐漸減小，分散的小面團使得醬醪整體呈現為較濃稠的狀態；發酵中后期，醬體出現大量氣孔分布；發酵終止時，氣孔消失，粘稠度適中。

甜面醬的感官形態變化與甜面醬發酵過程中的機理變化密切相關[17]。醬體顏色形成的可能原因有：葡萄糖α-羥基與氨基酸置換生成氨基糖，氨基糖作為醬體中色素組成，通常呈現棕紅色；同時，葡萄糖在高溫下脫水會形成焦糖，焦糖作為無定形的膠體物質，呈棕紅色；原料分解的酪氨酸經氧化作用生成黑色素，氨基酸與還原糖經美拉德反應生成類黑素；多酚類物質在多酚氧化酶作用下也會生成黑色素。醬體的香氣主要得益于揮發性物質的生成，通常為醇、醛、酸、酚類等物質；各種醇類物質又與醬中有機酸經酯化反應生成各種乙酯，酯類物質通常具有芳香，為香氣來源之一[18]。咸味由拌入的食鹽水帶來，存在于整個發酵階段。甜、鮮味隨著發酵進行而逐漸顯現，可能原因在于：原料中淀粉類物質轉化為葡萄糖、麥芽糖等，該類小分子還原糖產生明顯甜味，原料中蛋白質經曲霉蛋白酶降解為部分氨基酸呈現適度甜味；甜面醬的鮮味主要來源于小分子肽、核苷酸以及呈鮮味的氨基酸等[19]。隨著甜面醬趨于成熟，甜面醬滋味愈發爽口柔和，可能原因有：醬醪發酵過程中酒精發酵產生副產物甘油、高級醇等，此類物質具有一定的呈味作用，同時作為酯化反應的基礎物質，使得醬體滋味爽口柔和[20]。在不同的發酵階段，甜面醬呈現不同的醬體狀態，發酵初期甜面醬由于制曲結束，面糕上分布有米曲霉等霉菌菌絲，部分結塊，經拌鹽水入池后，有大塊團狀的面糕分布在醬體中。隨著發酵進行，原料中大分子物質降解，大塊面團逐漸呈小塊狀分布，此時醬醪略微干稠。發酵中期微生物產酸產氣作用明顯，使得醬醪中出現很多氣孔，到后期微生物出現消長變化，發酵趨于結束時，醬體中氣孔消失，甜面醬均勻無雜質。

4 結論

通過對甜面醬保溫發酵過程中反映發酵狀況的相應指標分析研究，所得如下結論：

甜面醬保溫發酵過程中含水量從最初的43.9%降低至成熟時的38.96%；總酸含量由0.67%增加至結束時的1.8%。保溫發酵0～20天，醬醪中還原糖與氨基酸態氮含量快速增加，分別由18.75%，0.22%上升到25.65%，0.37%；20～40天，兩種物質含量增加趨勢變緩，分別由25.65%，0.37%上升為27.3%，0.39%；40天之后，兩種物質含量則基本維持穩定。保溫發酵20～40天，此階段原料中淀粉及蛋白質類大分子物質得到最大程度的降解，此時的感官變化情況表明甜面醬尚未完全成熟，還需繼續發酵。因此，保溫發酵40天可達到保溫發酵快速降解原料中淀粉及蛋白質類大分子物質的目的。

通過對甜面醬保溫發酵過程中發酵機理的研究，可初步確定保溫發酵40天為保溫發酵階段結束的適宜階段，此時結束保溫發酵可進入下一曬露發酵階段繼續發酵。但是，因確定的適宜的保溫發酵時間階段跨度較大，還需進一步研究以明確保溫發酵終止的最佳時間。

[1]張玉玉,孫寶國,陳海濤,等.頂空-固相微萃取兩種傳統面醬揮發性成分的氣相色譜-質譜聯用分析[J].食品科技,2012,37(3):255-260.

[2]沈芳,吳華昌,鄧靜,等.四川甜面醬不同發酵工藝中的菌相分析[J].中國調味品,2013,38(6):41-45.

[3]李云霞.小麥醬發酵菌相分析與人工發酵技術研究[D].武漢：武漢工業學院,2012.

[4]金華勇.甜面醬發酵工藝試驗研究[D].武漢：湖北工業大學,2009.

[5]馮治平,吳士業.酶促法甜面醬生產工藝條件研究[J].食品科學,2008,29(9):358-360.

[6]吳虹.先保溫后曬露發酵法在甜面醬生產中的應用與探討[J].中國調味品,2014,39(11):53-55.

[7]李一豐,劉丹,尹顯鋒.甜面醬兩段式發酵模式的應用研究[J].食品技術研究,2015(21)：133-134.

[8]左勇,葉碧霞,楊小龍,等.甜面醬保溫發酵過程中揮發性成分的動態變化[J].食品工業科技,2016,37(19):314-319.

[9]GB/T 5009.40-2003,醬衛生標準的分析方法[S].

[10]SB/T 10317-1999，蛋白酶活力測定[S].

[11]王欽德,楊堅.食品試驗設計與統計分析(第2版)[M].北京:中國農業大學出版社,2009.

[12]Kim J S,Lee Y S.A study of chemical characteristics of soy sauce and mixed soy sauce: chemical characteristics of soy sauce [J].Eur Food Res Technol,2007,227(3):933-944.

[13]貢漢坤.傳統豆醬自然發酵的動態分析及人工接種多菌種發酵研究[D].無錫：江南大學,2004.

[14]張靜,趙長青,吳華昌,等.甜面醬保溫發酵過程中理化指標動態變化研究[J].食品與發酵科技,2014,50(2):39-42.

[15]方繼功.醬類制品生產技術[M].北京:中國輕工業出版社,2006.

[16]張靜,鄧靜,吳華昌,等.甜面醬保溫發酵過程中酶活的變化規律[J].食品與發酵科技,2014(3):32-35.

[17]Lioe H N,Apriyantono A,Takara K,et al.Umami taste enhancement of MSG/NaCl mixtures by subthreshold l-α-aromatic amino acids[J].J Food Sci,2005,70(7):401-405.

[18]付雯.多菌種耦合發酵甜面醬工藝研究[D].武漢：湖北工業大學,2011.

[19]Nishimura T,Kato H.Taste of free amino acids and peptides[J].Food Rev Int,1988,4(2):175-194.

[20]Breslin,Paul A S.Interactions among salty,sour and bitter compounds[J].Trends Food Sci Tech,1996,7(12):390-399.